袁銳 方蘋(píng) 劉訓(xùn)猛 陳靜 吳亞鋒 王晶晶 張仁展 劉肖漢

摘要：為探究異育銀鯽感染鯉皰疹病毒 2 型（Cyprinid herpesvirus 2，Cyhv-2）后對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，以人工注射方式使試驗(yàn)異育銀鯽感染 Cyhv-2，采用16S rRNA基因高通量測(cè)序分析對(duì)試驗(yàn)異育銀鯽腸道菌群的組成和多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，感染組鯽魚(yú)腸道菌群 Alpha 多樣性及均勻度均低于對(duì)照組鯽魚(yú);感染組與對(duì)照組鯽魚(yú)腸道菌群也產(chǎn)生了明顯的區(qū)別，兩者共有的優(yōu)勢(shì)菌屬僅有2種（鯨桿菌屬和假單胞菌屬），其中感染組的優(yōu)勢(shì)菌屬還包括Bacteroides（擬桿菌屬）、Aeromonas（氣單胞菌屬）、Vibrio（弧菌屬）、Shewanella（希瓦氏菌屬）這樣的致病菌屬，而對(duì)照組中鯽魚(yú)腸道優(yōu)勢(shì)菌群未見(jiàn)上述病原菌屬，表明 Cyhv-2 感染可改變鯽魚(yú)腸道原有微生態(tài)。本研究為感染 Cyhv-2 鯽魚(yú)腸道微生物與宿主的相互影響提供了很好的參考，為鯽魚(yú)造血器官壞死病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鯉皰疹病毒 2 型;異育銀鯽;腸道菌群

中圖分類號(hào)：S941.4?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1002-1302（2020）21-0196-06

已有研究表明，動(dòng)物腸道內(nèi)生活著大量而復(fù)雜的微生物，包括真核微生物、細(xì)菌、古細(xì)菌和病毒等[1-2]，在演變和適應(yīng)過(guò)程中逐漸形成了腸道菌群，作為生物體“被遺忘的器官”在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用，它們含有的基因也被稱為生物體的“第二基因組”[3]。近年來(lái)，腸道菌群與宿主健康的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)，魚(yú)類作為一種水生動(dòng)物，受環(huán)境影響和作用，其腸道內(nèi)亦進(jìn)化出與所處環(huán)境相適應(yīng)的正常菌群[4]，它們?cè)谡{(diào)節(jié)宿主生理生化反應(yīng)、促進(jìn)消化吸收、介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答和抵御宿主疾病發(fā)生等方面發(fā)揮著重要的作用，而腸道中的有益菌群可分泌多糖、脂類、維生素、相關(guān)活性酶類等一系列代謝產(chǎn)物，共同促進(jìn)了免疫系統(tǒng)的作用[5]。

魚(yú)腸道內(nèi)棲息著大量的正常菌群，它們覆蓋在腸道表面黏膜上，形成一道天然拮抗致病菌入侵的機(jī)械屏障，同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性免疫反應(yīng)，與宿主共同維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，加強(qiáng)對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)[6]。有研究表明，腸道菌群與宿主間的復(fù)雜相互作用始于宿主出生之后，Sugita 等研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)Oreochromis mossambicus仔魚(yú)在孵出 20～60 d 后，腸道內(nèi)開(kāi)始有菌群定殖。魚(yú)類腸道菌群的數(shù)量和組成，與種類、生長(zhǎng)與棲息環(huán)境、是否投餌、投飼策略、腸道菌群的數(shù)量和組成，這些因素既統(tǒng)一又相互作用[7]。有研究表明，李學(xué)梅等采用PCR- DGGE指紋技術(shù)研究了斑點(diǎn)叉尾、銀鯽和異育銀鯽腸道微生物群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在斑點(diǎn)叉尾腸道中檢測(cè)到的菌群主要是變形桿菌門(mén)，而銀鯽和異育銀鯽腸道中菌群主要包括梭桿菌門(mén)中的類群，還包括變形桿菌門(mén)中的氣單胞菌，及一些未知的類群[8]。

鯽魚(yú)（Carassius auratus）作為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類，在江蘇、湖北等地養(yǎng)殖產(chǎn)量極高，根據(jù)2018年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，僅2017年，全國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量就達(dá)282萬(wàn)t，產(chǎn)值高達(dá)100億元。然而，近年來(lái)，鯉皰疹病毒 2 型（CyHV-2）感染引起的鯽魚(yú)造血器官壞死病[9]嚴(yán)重危害鯽魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，僅2012年就導(dǎo)致江蘇省異育銀鯽發(fā)病面積 3萬(wàn)hm2，發(fā)病區(qū)域死亡率極高，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，有關(guān)鯽魚(yú)腸道菌群的研究局限于復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)異育銀鯽腸道菌群的影響[10]，以及健康鯽魚(yú)腸道菌群的分析[11-12]，關(guān)于鯉皰疹病毒2型感染對(duì)于鯽魚(yú)腸道菌群的影響研究還未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)此，本研究運(yùn)用高通量測(cè)序，對(duì)健康鯽魚(yú)和人工感染 CyHV-2 鯽魚(yú)腸道菌群進(jìn)行了比較研究，以期為該病的防治提供腸道微生物方面的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)鯽魚(yú)（體質(zhì)量80～100 g/尾）來(lái)自江蘇江都淥洋湖水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，采樣前1個(gè)月轉(zhuǎn)移至江蘇省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心室內(nèi)養(yǎng)殖循環(huán)系統(tǒng)，水溫控制在22～26 ℃，期間投喂高蛋白鯽魚(yú)人工配合飼料。馴化3周后選擇規(guī)格相同的鯽魚(yú)隨機(jī)分成病毒感染組和對(duì)照組。病毒感染組鯽魚(yú)通過(guò)肌肉注射病魚(yú)組織勻漿液（組織勻漿液需用0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌），對(duì)照組鯽魚(yú)則通過(guò)肌肉注射無(wú)菌生理鹽水（同樣要用0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌）作對(duì)照處理。試驗(yàn)4 d后，病毒感染組出現(xiàn)明顯癥狀，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，確已感染 CyHV-2。隨機(jī)取 3 尾感染組鯽魚(yú)和健康組鯽魚(yú)進(jìn)行后續(xù)分析。腸道菌群樣品取整個(gè)腸道用來(lái)提取菌群 DNA，樣品的具體采集和處理方法參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.2 病毒感染組分子生物學(xué)鑒定

病毒感染組 CyHV-2 分子生物學(xué)檢測(cè)參照國(guó)標(biāo)《金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)方法》（GB/T 36194—2018）中推薦的檢測(cè)流程和技術(shù)參數(shù)進(jìn)行。參照生工生物工程（上海）股份有限公司病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組DNA。以提取的病毒 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，分別擴(kuò)增 DNA 聚合酶基因（362 bp）和解旋酶基因（366 bp）。反應(yīng)體系如下：Premix TaqTM 25 μL，上下游引物各1 μL（濃度為10 μmol/L），DNA模板為2.5 μL，加 ddH2O 20.5 μL，總反應(yīng)體系為50 μL;PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性1 min，55 ℃（聚合酶基因）或60 ℃（解旋酶基因）退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測(cè)與分析。

1.3 鯽魚(yú)腸道菌群16S rRNA基因高通量測(cè)序分析

樣品腸道組織用無(wú)菌的剪刀剪碎后，放入2 mL離心管中，加入適量鋼珠和800 μL SLX，在破碎儀上進(jìn)行破碎后提?。ň唧w提取步驟參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，見(jiàn)附錄一），提取好后的DNA用瓊脂糖凝膠方法檢測(cè)其完整性。利用Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量進(jìn)行2輪擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增步驟如下：30 μL反應(yīng)體系中包含2×Taq master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F（10 μmol/L） 1 μL，Primer R （10 μmol/L） 1 μL，模板DNA 2 μL（20 ng），H2O 11 μL;第一輪PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 3 min，后接5個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s），再接20個(gè)循環(huán)（94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s），之后72 ℃ 5 min。第二輪擴(kuò)增用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，其余條件一樣，程序如下：95 ℃ 3 min，后接5個(gè)循環(huán) （94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s），之后 72 ℃ 5 min，PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)回收。對(duì)于細(xì)菌和古菌擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）處理回收。對(duì)于真菌PCR產(chǎn)物和其他擴(kuò)增片段<400 bp的PCR產(chǎn)物，選用0.8倍的磁珠處理回收。利用Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，以方便按照1 ∶ 1的等量混合后測(cè)序，等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol。定量后，使用MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，所得到DNA序列分析進(jìn)行分析，并通過(guò)RDP（Ribosomal Database Project）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和OTU分類。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分析過(guò)程使用R語(yǔ)言環(huán)境和PAST 2.0軟件，其中，R語(yǔ)言使用了Vegan、VennDiagram、ggplot 2和 ggfority 程序包。進(jìn)行的主要分析包括：OUT 聚類分析;Alpha 多樣性分析，計(jì)算ACE、Chao、Shannon、Simpson、Coverage等物種多樣性指數(shù)，并制作所有樣品ACE、Chao、Shannon、Simpson、Richness指數(shù)的箱形圖;根據(jù)各樣本在 OTU 的分布情況繪制韋恩圖;樣本間菌群豐度差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 檢測(cè)結(jié)果

病毒感染組的鯽魚(yú)樣品在攻毒試驗(yàn)后1周內(nèi)相繼發(fā)病，呈現(xiàn)典型的鯽魚(yú)造血器官壞死病癥狀，表現(xiàn)為鰓出血，體表尤其是鰭條基部出血紅腫，而對(duì)照組鯽魚(yú)健康，無(wú)明顯癥狀;取病魚(yú)的鰓、腎、脾、肝等組織提取病毒基因組進(jìn)行 PCR檢測(cè)，獲得了片段大小分別為366 bp 和 362 bp 的特異性條帶（圖1），結(jié)果均呈 Cyhv-2 陽(yáng)性。

2.2 腸道菌群 OTU 聚類分析

對(duì)感染組和對(duì)照組各樣本的腸道菌群進(jìn)行基于 Bray-Curtis 方法的 OTU 樣本聚類，由圖2可知，樹(shù)枝的長(zhǎng)度代表樣本間的距離，越相似的樣本會(huì)越靠近，圖中同一顏色的樹(shù)枝表示來(lái)源于同一組，對(duì)照組（H）和感染組（D）的3個(gè)樣本分別聚在了一起，說(shuō)明感染 CyHV-2 后的鯽魚(yú)腸道菌群 OTU 豐度與對(duì)照組相比，出現(xiàn)了明顯的分化。

OTU 分布韋恩圖可以用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣本中共有的和獨(dú)有的 OTU 數(shù)目，直觀地展現(xiàn)出環(huán)境樣品的 OUT 數(shù)目及重疊情況，感染組和對(duì)照組的鯽魚(yú)腸道菌群 OTU 分布韋恩圖（圖3）表明，感染組與對(duì)照組的共有 OTU 數(shù)目?jī)H為 12 個(gè)，對(duì)照組3個(gè)樣本的 OTU 數(shù)達(dá)到 929 個(gè)，而感染組3個(gè)樣本的 OTU 數(shù)僅 541 個(gè)，相比對(duì)照組減少了 388 個(gè)，表明感染 Cyhv-2 后的鯽魚(yú)腸道菌群 OTU 豐度明顯降低。

2.3 腸道菌群 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性是對(duì)樣品物種多樣性的分析，基于 OTU 結(jié)果計(jì)算樣品的Alpha 多樣性指數(shù)，包括估算樣品 OTU 數(shù)量的 Chao 指數(shù)和 ACE 指數(shù)以及樣品微生物多樣性的辛普森指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)。由圖4可知，每個(gè)盒代表1個(gè)分組下面所有樣本的 Alpha 指數(shù)（分別是Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)、辛普森多樣性指數(shù)），可以直觀地發(fā)現(xiàn)每組樣本下的多樣性指數(shù)情況，盒子越窄說(shuō)明該組內(nèi)相關(guān)多樣性指數(shù)越低，越寬則說(shuō)明多樣性指數(shù)越高。腸道菌群 Alpha 多樣性分析結(jié)果表明，感染組的 Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)、辛普森指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)均低于對(duì)照組（圖4），其中，Chao 指數(shù)、ACE指數(shù)達(dá)到顯著差異水平（t-test，P<0.05），說(shuō)明 CyHV-2 感染使鯽魚(yú)腸道菌群的豐度、多樣性、均勻度都明顯降低。

2.4 腸道菌群組成及相對(duì)豐度分析

首先比較了感染組與對(duì)照組鯽魚(yú)腸道微生物在門(mén)水平上的組成及相對(duì)豐度。結(jié)果表明，無(wú)論感染組還是對(duì)照組，均檢測(cè)到 23 個(gè)菌門(mén)（圖5），分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、糖化細(xì)菌門(mén)（Candidatus Saccharibacteria）、衣原體門(mén)（Chlamydiae）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）、酸酐菌門(mén)（Acidobacteria）、螺旋菌門(mén)（Spirochchaetes）、互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、纖維桿菌門(mén)（Fibrobacteres）、懶桿菌門(mén)（Ignavibacterla）、奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）、綠菌門(mén)（Chlorobi）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、裝甲菌門(mén)（Armatimonadetes）、Parcubacteria。其中，感染組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（圖6）為變形菌門(mén)（52.06%）、梭桿菌門(mén)（31.52%）、擬桿菌門(mén)（11.15%）、放線菌門(mén)（2.77%），4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在感染組鯽魚(yú)腸道菌群中所占比例為97.5%;對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（圖7）為變形菌門(mén)（77.88%）、梭桿菌門(mén)（15.03%）、浮霉菌門(mén)（2.72%）、放線菌門(mén)（1.87%），4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在對(duì)照組鯽魚(yú)腸道菌群中所占比例為97.5%。

將屬水平上主要菌群進(jìn)行分析（表1）發(fā)現(xiàn)，感染組鯽魚(yú)腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌屬有 8 種，分別是鯨桿菌屬（31.39%）、假單胞菌屬（22.33%）、擬桿菌屬（10.85%）、氣單胞菌屬（9.72%）、希瓦氏菌屬（7.55%）、弧菌屬（5.56%）、短波單胞菌屬（1.4%）、鞘氨醇單胞菌（1.33%）;對(duì)照組鯽魚(yú)腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌群則有10種，分別是檸檬酸桿菌屬（23.91%）、芽殖桿菌屬（21.28%）、鯨桿菌屬（15.03%）、包西氏菌屬（11.78%）、根瘤菌屬（4.66%）、不動(dòng)桿菌屬（3.49%）、假單胞菌屬（3.18%）、水球菌屬（1.58%）、艾克曼菌屬（1.24%）、紅桿菌屬（1.18%）。將感染組與對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)比發(fā)現(xiàn)，感染組的鯽魚(yú)腸道優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生明顯變化，兩者共有的優(yōu)勢(shì)菌屬僅有2種（鯨桿菌屬和假單胞菌屬），相對(duì)豐度相比對(duì)照組也都有所下降。除了共有優(yōu)勢(shì)菌屬外，感染組和對(duì)照組各有 6 種或 8 種獨(dú)有優(yōu)勢(shì)菌種，其中感染組的優(yōu)勢(shì)菌屬還包括擬桿菌屬、氣單胞菌屬、弧菌屬、希瓦氏菌屬這樣的致病菌屬，而對(duì)照組中鯽魚(yú)腸道優(yōu)勢(shì)菌群未見(jiàn)上述病原菌屬。分析認(rèn)為，感染鯉皰疹病毒 2 型對(duì)鯽魚(yú)腸道菌群產(chǎn)生了較為明顯的影響，一些常見(jiàn)的腸道菌群被病原菌所取代。

3 討論

魚(yú)類腸道微生物菌群與宿主的免疫等密切相關(guān)，有研究表明，魚(yú)腸道表面黏膜上覆蓋著大量的正常菌群，從而形成一道天然抵御致病菌侵入的機(jī)械屏障[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類腸道菌群的變化與免疫機(jī)能的改變有著密切的聯(lián)系，李莉等研究表明，隨著草魚(yú)腸道中氣單胞菌屬細(xì)菌比例下降而腸桿菌科細(xì)菌含量上升時(shí)，草魚(yú)白細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)明顯上升，說(shuō)明草魚(yú)腸道優(yōu)勢(shì)菌群的變化可能與增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬活性有關(guān)[4]。因此，維持魚(yú)類腸道正常菌群的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)宿主生命活動(dòng)至關(guān)重要。

影響腸道菌群組成的因素有很多，水環(huán)境、投喂飼料、轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用乃至病原的感染均能對(duì)魚(yú)類腸道菌群產(chǎn)生顯著影響。涂宗財(cái)?shù)妊芯苛怂h(huán)境中重金屬銅對(duì)異育銀鯽腸道微生物的影響，受到重金屬脅迫處理后的異育銀鯽腸道微生物多樣性明顯降低[15];宦海琳等研究了復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)異育銀鯽腸道菌群的影響，證實(shí)在飼料中添加適量的復(fù)合微生態(tài)制劑可有效改善異育銀鯽腸道微生態(tài)平衡，有益于消化酶的分泌和營(yíng)養(yǎng)吸收[10];饒劉瑜等對(duì)轉(zhuǎn)基因鯉魚(yú)與對(duì)照鯉腸道微生物群落差異進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在3個(gè)不同的發(fā)育時(shí)期，轉(zhuǎn)基因組鯉魚(yú)腸道微生物群落組成與對(duì)照組鯉魚(yú)相比發(fā)生了明顯改變[16];朱文根等研究了感染草魚(yú)呼腸孤病毒對(duì)腸道菌群多樣性的影響，證實(shí) GCRV 的感染可使草魚(yú)腸道微生態(tài)發(fā)生紊亂，群落豐度與多樣性等均明顯下降[17];李東亮等用嗜水氣單胞菌感染草魚(yú)發(fā)現(xiàn)，草魚(yú)腸道微生物菌群多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群均發(fā)生了明顯變化[18]。

雖然已有研究表明，病原感染可引起水生動(dòng)物腸道菌群紊亂，但是 Cyhv-2 的感染對(duì)鯽魚(yú)腸道菌群的影響尚不清楚。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究了 Cyhv-2 感染對(duì)鯽魚(yú)腸道菌群的影響，結(jié)果表明 Cyhv-2 的感染使得鯽魚(yú)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著變化，Cyhv-2 感染組鯽魚(yú)腸道菌群 Alpha 多樣性顯著低于對(duì)照組鯽魚(yú)，優(yōu)勢(shì)菌屬亦發(fā)生明顯變化，病原菌明顯增多，說(shuō)明感染 Cyhv-2 使得鯽魚(yú)腸道微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生了紊亂。

已有研究表明，變形菌門(mén)是魚(yú)類腸道微生物中最主要類群之一[19]，本研究結(jié)果顯示，無(wú)論是感染組還是對(duì)照組，變形菌門(mén)均是鯽魚(yú)腸道最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。研究發(fā)現(xiàn)，感染組異育銀鯽腸道中隸屬于變形菌門(mén)的氣單胞菌屬和弧菌屬與對(duì)照組相比，其豐度呈上升趨勢(shì)，由于氣單胞菌屬中的致病性氣單胞菌以及弧菌屬中的副溶血性弧菌均為魚(yú)類的主要致病菌，因此氣單胞菌和弧菌屬的數(shù)量上升，提示感染 Cyhv-2 后，異育銀鯽體內(nèi)存在混合細(xì)菌感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，這為異育銀鯽的病毒細(xì)菌混合感染提供了理論依據(jù)，對(duì)于感染 Cyhv-2 后的異育銀鯽養(yǎng)殖綜合防控提供了理論支撐。

本研究表明，Cyhv-2 的感染會(huì)引起異育銀鯽腸道正常菌群紊亂。腸道優(yōu)勢(shì)菌群的改變往往會(huì)加劇魚(yú)體免疫力下降，進(jìn)而加重腸道微生態(tài)失衡，導(dǎo)致致病菌過(guò)度增殖，從而使鯽魚(yú)遭受細(xì)菌激發(fā)感染。因此，如果能夠在易發(fā)病水溫來(lái)臨前，投喂一些易于在異育銀鯽腸道定殖的有益微生態(tài)制劑，或許可以穩(wěn)定鯽魚(yú)腸道菌群，從而緩解鯽魚(yú)的病毒細(xì)菌混合感染，為緩解鯽魚(yú)造血器官壞死病提供幫助。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bjrkstén B. The gut microbiota：a complex ecosystem[J]. Clinical and Experimental Allergy，2006，36（10）：1215-1217.

[2]蔣 葛，沈 輝，萬(wàn)夕和，等. 凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥病蝦與健康蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌群比較分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（1）：142-148.

[3]童雨心，梁迎春. 腸道微生物與人體健康研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊，2014（6）：896-900.

[4]李 莉. 草魚(yú)腸道菌群的變化和免疫功能的關(guān)系[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[5]Han S F，Liu Y C，Zhou Z G，et al. Analysis of bacterial diversity in the intestine of grass carp （Ctenopharyngodon idellus） based on 16S rDNA gene sequences[J]. Aquaculture Research，2010，42（1）：47-56.

[6]宋增福，吳天星. 魚(yú)類腸道正常菌群研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2007，26（8）：471-474.

[7]Sugita H，F(xiàn)ushino T，Oshima K，et al. Microflora in the water and sediment of freshwater culture ponds[J]. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1985，51（1）：91-97.

[8]李學(xué)梅，余育和，解綬啟，等. 三種室內(nèi)飼養(yǎng)魚(yú)類腸道微生物群落PCR-DGGE指紋分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2011，35（3）：423-429.

[9]袁 銳，陳 靜，劉訓(xùn)猛，等. 鯉皰疹病毒2型研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志，2019，32（1）：38-45.

[10]宦海琳，丁 麗，周維仁，等. 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)異育銀鯽腸道菌群和消化機(jī)能的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（3）：604-610.

[11]侯進(jìn)慧，陳宏偉，曹澤虹，等. 鯽魚(yú)腸道細(xì)菌菌群初步分析[J]. 食品科學(xué)，2010，31（11）：178-181.

[12]陳芳梅，李 偉，劉 蔚，等. 大鼠與鯽魚(yú)腸道內(nèi)含物中微生物菌群的研究[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2019，36（1）：48-51.

[13]Wang C，Ni J J，Yan Q Y，et al. Comparision of the intestitinal bacterical communities between grass carp （Ctenopharyngodon idellus） and bluntnose black bream （Megalobrama amblycephala）[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，2014，38（5）：868-875.

[14]孫敬鋒，賈艷麗. 魚(yú)類腸道菌群與免疫調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2016，43（2）：96-100.

[15]涂宗財(cái)，龐娟娟，王 輝，等. 水環(huán)境中重金屬銅對(duì)異育銀鯽腸道微生物的影響[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2017，57（7）：1060-1068.

[16]饒劉瑜，李學(xué)梅，李星浩，等. 轉(zhuǎn)基因鯉魚(yú)與對(duì)照鯉腸道微生物群落差異研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2018，42（2）：349-355.

[17]朱文根，李星浩，饒劉瑜，等. 感染草魚(yú)呼腸孤病毒對(duì)腸道菌群多樣性的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2019，43（1）：109-116.

[18]Li D L. Study of the intestinal flora structure of grass carp infection with aeromonas hydrophila[D].

[19]Cottrell M T，Kirchman D L. Natural assemblages of Marine proteobacteria and members of the Cytophaga-Flavobacter cluster consuming low- and high-molecular-weight dissolved organic matter[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（4）：1692-1697.肖金星，鐘志文，相興偉，等. 南極磷蝦粉對(duì)黑鯛幼魚(yú)生長(zhǎng)性能和氟蓄積的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（21）：202-206.