李興才，潘成勇，李 輝*，楊華婷，陳 林

（1.貴州大學動物科學學院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.凱里鳳凰苑畜牧養(yǎng)殖有限公司，貴州凱里 556000）

雞的羽毛顏色受多個等位基因控制，目前已經發(fā)現(xiàn)存在5 對等位基因，分別為抑制色素形成基因I、色素原基因C、氧化酶基因O、抑制色素表現(xiàn)基因P以及非白化基因A，其中只有I基因和C基因已分別被定位于PMEL17與TYR基因上，其他基因未見報道[1]。I基因存在時，無論其他基因是否顯隱性都表現(xiàn)為白羽型，因此通常被稱為顯性白羽；隱性白羽情況比較復雜，但目前為止對于C基因控制的白羽研究比較多，因此由C基因控制的白羽通常稱為隱性白羽。Kerje 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，PMEL17基因第十外顯子區(qū)域插入了一段9 bp 的核苷酸序列導致黑色素基因非正常轉錄翻譯，引起顯性白羽產生。Chang 等[3]研究得出TYR（絡氨酸酶基因）第四內含子區(qū)域插入了一段長7.7 kp 的內源性白血病病毒ALV 序列，導致TYR基因轉錄物中缺少第五外顯子編碼的跨膜結構域而無法正常轉錄，從而使絡氨酸酶失去正常功能活性，致使黑色素無法合成，導致隱性白羽形成。中國消費者對雞羽毛顏色具有一定偏好，認為白色是一種不吉利的顏色，因此本研究對雞群白羽與有色羽鑒定具有一定的研究價值。

香爐山雞系貴州省凱里地區(qū)苗族人民從中原遷徙到西南后，在香爐山區(qū)域長期封閉的自然條件下形成的原始類群，主要分布于貴州省黔東南凱里、麻江、黃平、丹寨等縣。香爐山雞體型矮小、結實緊湊、結構勻稱，具有耐粗飼、抗逆性強、無應激、抗病能力強、營養(yǎng)豐富、肉質鮮美等特點[4-5]。在香爐山雞群體中，有千分之二左右的白羽雞出現(xiàn)，經研究分析為隱性白羽等位基因造成，其中雜合子個體表型與顯性純合子表現(xiàn)一致，但部分雜合子雞群翅膀和尾部羽毛出現(xiàn)白斑現(xiàn)象，因此凱里鳳凰苑畜牧養(yǎng)殖有限公司計劃在香爐山雞選育中剔除雜合子個體，建立麻羽和白羽2 個品系。采用傳統(tǒng)選育一般要連續(xù)幾個世代才能淘汰雜合子雞群，耗時耗力，本研究利用分子輔助標記技術對香爐山雞隱性白羽進行鑒定，成本低廉、準確度高，只需一代就能淘汰全部雜合子，能夠有效縮短育種周期，加快育種進展。本研究將為香爐山雞種質資源保護、開發(fā)與利用奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗選用的香爐山雞來自貴州省黔東南州凱里市鳳凰苑畜禽養(yǎng)殖有限公司種雞擴繁場，其中有色羽60 只、白羽60 只，公母各半。使用EDTA 抗凝管翅靜脈采血，采血過程中快速顛倒混勻，置于低溫泡沫盒內帶回實驗室，-20℃保存用于總DNA 提取。

1.2 基因組DNA 提取 利用血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）對香爐山雞基因組DNA 進行提取，紫外分光光度計檢測其濃度，OD 值在1.8～2.0 為合格。利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，合格DNA 樣品分裝于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計及PCR 擴增 根據GenBank 發(fā)布的TYR基因第四內含子序列含ALV 插入序列結合TYR第四內含子未含插入序列作為參考，利用引物設計軟件Primer 5.0 和Oligo 6.0 進行多重PCR 引物設計。NCBI上參考序列GenBank 登錄號分別為DQ118701.1 和DQ118702.1。引物設計特點是共用同一條上游引物，總共2 對3 條引物，分別命名為F、R1、R2。引物F：5'-GGGAAACTTTAAGGACTGGTGGA-3'，R1：5'-CTG GGTAGATGGACAGACCGTTG-3'，R2：5'-CAAGAGG CACAAGGAGTGGGACA-3'，序列送往上海英濰捷基生物有限公司進行引物合成。

PCR 擴增運用15 μL 反應體系：1 個上游和2 個下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，（80 ng/μL）模板DNA 1 μL，2×Es Taq Master Mix 7 μL，ddH2O 4 μL。反 應 條件為：95 ℃預變性5 min；95℃變性45 s、59.2℃退火45 s、72℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72℃終延伸8 min，4℃保存。

1.4 統(tǒng)計分析 將香爐山雞隱性白羽基因PCR 擴增產物用1.0% 的瓊脂糖凝膠、130 V 電泳30min 進行檢測，用凝膠成像系統(tǒng)對檢測結果進行拍照讀取。根據鑒定結果挑選2 種純合子PCR 產物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序驗證，應用Popgene2.1 軟件對香爐山雞鑒定結果進行平均等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shanon 指數、多態(tài)信息含量（PIC）、等位基因頻率、基因型頻率等計算。

2 結果

2.1 隱性白羽C 基因鑒定分析 本研究提取的DNA 經瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰明亮，無嚴重拖帶，說明提取效果較好，可以用于后續(xù)實驗。實驗利用2 對3 條F、R1、R2 引物對120 只香爐山雞隱性白羽基因型進行雙重PCR 鑒定分析。結果顯示PCR 擴增產物在1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測中產生3 種類型的條帶，其中只能夠得出169 bp 條帶的待測雞等位基因型為cc 的隱性白羽純合型，只得出526 bp 條帶的待測雞等位基因型為CC 的有色羽純合型；如果同時得出169 bp 和526 bp 2條帶的待測雞等位基因型為Cc 的有色雜合型，凝膠電泳檢測結果如圖1～5 所示。統(tǒng)計得出CC 型為56 個，占總群體46.67%；Cc 型為4 個，占3.33%；cc 為60 個，占50%。能夠成功鑒定出隱性白羽cc 型與尾部白斑雜合子Cc 型，為香爐山雞剔除雜合子建立2 個純合子雞群提供理論依據。鑒定出60 只白羽雞群全部為隱性純合，60 只有色羽樣品未出現(xiàn)隱性白羽純合基因型，與表現(xiàn)型結果一致，說明鑒定結果準確可靠。

利用Popgene 2.1 軟件對隱性白羽C 基因多態(tài)性分析得出Na 為2、Ne 為1.997 8，如表1 所示。Shannon指數為0.692 6、PIC 為0.374 7，0.25＜PIC＜0.50，該位點為中度多態(tài)，Shannon 指數與PIC 具有一致性，說明香爐山雞隱性白羽基因多態(tài)性比較豐富，具有一定的選育空間。

3 討 論

雞的羽毛顏色性狀是消費者比較關心的質量性狀。羽毛顏色種類繁多，主要分為有色羽和白羽兩類。羽色形成過程比較復雜，受多種色素原基因控制[6]，正是這樣形成了各具特色的地方品種資源。在香爐山雞選育中發(fā)現(xiàn)隱性白羽的存在，雞群白羽基因雜合子中部分出現(xiàn)翅膀和尾部白斑現(xiàn)象，為更好地保護、開發(fā)、利用這一類群，本研究采用分子輔助標記選育方法，利用多重PCR 結合瓊脂糖凝膠電泳技術，快速鑒定分離淘汰雜合子。相對于傳統(tǒng)的選育方式，該方法成本低廉、準確度高、省時省力，同時具備有效縮短育種周期、加快育種進展等優(yōu)點，有利于香爐山雞2 個核心群快速建立，防止優(yōu)良的地方種質資源流失。

隱性白羽主要是色素原基因C起主導作用，它被定位于TYR基因上。TYR是一種含銅的金屬酶，是黑色素形成的關鍵酶[7]，而黑色素是否表達與隱性白羽的形成密切相關。研究證明TYR基因第四內含子區(qū)域插入內源性白血病病毒ALV 序列，導致隱性白羽形成[8]。因此，本研究利用TYR基因的這一特性，合理地設計出鑒定隱形白羽的雙重PCR 引物，成功鑒定分離香爐山雞隱性白羽，同時成功淘汰該類群隱性白羽雜合子，建立麻羽與隱性白羽2 個純合群體。

表1 香爐山雞隱性白羽基因位點多態(tài)性

隱性白羽純合雞具有體格健壯、性情溫順、繁殖性能好等特點[9]，用于其他品種的改良可以對繁殖性能、生長性能等方面進行改進，由于白羽對其他羽色為隱性的緣故，因此不會大面積改變改良品種羽毛顏色，只是翅膀與尾部出現(xiàn)部分白斑，因而能夠最大程度保持原品種性狀特征[10-13]，因此可以嘗試將隱性白羽雞群作為其他品種的改良材料。

4 結 論

本研究通過對120 只香爐山雞隱性白羽進行鑒定分析，經雙重PCR 擴增結合瓊脂糖凝膠電泳檢測技術成功鑒定隱性白羽基因型，將香爐山雞雜合子雞淘汰，建立2 個純合雞群；對隱性白羽基因位點進行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，PIC 為0.374 7，屬于中度多態(tài)，說明該品種具有一定的選育空間。