喬延召，劉國(guó)乾,2，陶 劍，石俊松，衛(wèi)恒習(xí)，張守全*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；2.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東廣州 510640；3.廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司，廣東新興 527439）

生殖細(xì)胞是多細(xì)胞生物體內(nèi)能繁殖后代的細(xì)胞總稱(chēng)，包括原始生殖細(xì)胞（Primordial Germ Cells，PGCs）、生殖母細(xì)胞和成熟配子（精子和卵子）。生殖細(xì)胞的形成是一個(gè)細(xì)胞特異性分化過(guò)程，這種特異性分化最早體現(xiàn)在PGCs 的形成，PGCs 是最早出現(xiàn)的生殖細(xì)胞，其在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)方面與體細(xì)胞均有不同，PGCs 發(fā)育過(guò)程大致分為3 個(gè)階段：胚胎尿囊早期形成及命運(yùn)決定過(guò)程；后腸和腸系膜的中期遷移；生殖嵴的后期分化[1]。在小鼠生殖細(xì)胞發(fā)育中，PGCs 經(jīng)過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程最終形成成熟配子[2]，該過(guò)程是在生殖細(xì)胞特異性基因及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控下完成，體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平，包括轉(zhuǎn)錄因子、表觀修飾、RNA 結(jié)合蛋白等作用方式[3]。SOHLH1（Spermatogenesis-and Oogenesisspecific Basic Helix-loop-helix-containing Protein 1）與SOHLH2（Spermatogenesis-and Oogenesis-specific Basic Helix-loop-helix-containing Protein 2）是一類(lèi)螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（Helix-loop-helix，HLH），具備DNA 結(jié)合蛋白的2 個(gè)共同特點(diǎn)，即存在與DNA 結(jié)合的螺旋區(qū)及能形成二聚體。此類(lèi)蛋白具有HLH 基序，并且在其相鄰區(qū)域存在著強(qiáng)堿性，是與DNA 結(jié)合所必需的。Ballow 等[4-5]在2006 年首先發(fā)現(xiàn)SOHLH1 與SOHLH2為生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，并證明其對(duì)生殖細(xì)胞的早期分化具有重要作用。趙涵[6]研究表明，SOHLH1缺失能導(dǎo)致小鼠卵巢早衰（Premature Ovarian Failure，POF），SOHLH1是卵巢早衰的候選基因之一。本文就生殖細(xì)胞特異性基因SOHLH1與SOHLH2在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期利用生殖細(xì)胞特異性啟動(dòng)子制備人類(lèi)生殖疾病動(dòng)物模型，為人類(lèi)生殖器官或生殖障礙疾病的治療提供參考。

1 生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1 與SOHLH2的進(jìn)化

筆者從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了SOHLH1與SOHLH2基因的氨基酸序列，以各物種SOHLH1、SOHLH2基因所編碼的氨基酸為基礎(chǔ)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，采用自動(dòng)填充缺口的ClustalW 方法比對(duì)，使用臨近比較法作圖（1 000 個(gè)bootstrap 重復(fù)）[7-8]。圖1 和圖2 顯示了兩者在哺乳動(dòng)物上從低等的鼠科到高等的靈長(zhǎng)類(lèi)人的演化過(guò)程。

2 SOHLH1 與SOHLH2 在小鼠中的時(shí)空表達(dá)

小鼠胚胎期12.5 d 卵泡即可檢測(cè)到SOHLH1基因mRNA 的表達(dá)，15.5 d 卵泡即可檢測(cè)到蛋白質(zhì)水平的表達(dá)[6]。出生7 d 后的小鼠以及成年小鼠的睪丸A 型精原細(xì)胞中均能檢測(cè)到SOHLH1 蛋白，但剛出生的小鼠睪丸內(nèi)檢測(cè)不到，進(jìn)一步檢測(cè)成年小鼠睪丸中各形態(tài)精子，發(fā)現(xiàn)SOHLH1最初在生精上皮周期IV 階段的精原細(xì)胞（Spermatogonia）中表達(dá)，在Aal、A1、A2、A3、A4 各類(lèi)型精原細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，在B 型精原細(xì)胞上中等表達(dá)，這表明SOHLH1表達(dá)伴隨著精子的分化形成過(guò)程[4]。Suzuki 等[9]利用SOHLH1基因的這種特性，使用小鼠SOHLH1基因啟動(dòng)子制備了攜帶CherryFlag 標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因小鼠，以此來(lái)研究早期精子分化的動(dòng)態(tài)變化及純化各種類(lèi)型的精子。在卵子發(fā)生過(guò)程中，SOHLH1基因mRNA 在13.5 d 可被檢測(cè)到低水平轉(zhuǎn)錄，在卵子進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ期（15.5 d）時(shí)顯著表達(dá)，直到小鼠出生后原始卵泡（Primordial Follicles）中仍可檢測(cè)到SOHLH1基因的mRNA；SOHLH1基因表達(dá)的蛋白在原始生殖細(xì)胞囊、原始卵泡、初級(jí)卵泡（Primary Follicle）中均能檢測(cè)到，但在次級(jí)卵泡（Secondary Follicles）中未檢測(cè)到；SOHLH1 蛋白不同于其他卵細(xì)胞特異性調(diào)控子，其存在于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，缺少核定位信號(hào)，這種作用方式表明SOHLH1 在卵泡早期發(fā)育中發(fā)揮著獨(dú)特作用[10]，其在卵子發(fā)生及正常形態(tài)卵子的生成中所發(fā)揮的重要作用亦被證實(shí)（圖3 和4）[11-12]。

SOHLH2基因mRNA 在13.5 d 的小鼠雌雄生殖腺內(nèi)能夠被檢測(cè)到，在雄性小鼠的精原干細(xì)胞（Spermatogonia Stem Cells,SSCs）至精母細(xì)胞（spermatocyte）中都可以檢測(cè)到，而在雌性小鼠中只持續(xù)到原始卵泡這一階段；SOHLH2 蛋白可以在雄性小鼠胚胎期18.5 d 生殖母細(xì)胞中檢測(cè)到，然后一直持續(xù)到成年小鼠的B 型精原細(xì)胞，在雌性小鼠17.5 d 生殖母細(xì)胞中檢測(cè)到SOHLH2 蛋白的表達(dá)，并且蛋白的表達(dá)持續(xù)到成年小鼠的小卵泡、原始卵泡及初級(jí)卵泡中[5,13]。無(wú)論在雄性小鼠還是在雌性小鼠上，SOHLH2基因總是先于SOHLH1基因表達(dá)[14]。

3 SOHLH1 與SOHLH2 的功能和調(diào)控機(jī)制

SOHLH1 與SOHLH2 作為生殖細(xì)胞特異性基礎(chǔ)型螺旋-環(huán)-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在配子生成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[15]，其作用機(jī)制隨著研究的深入被逐步闡明。在卵子生成及早期發(fā)育過(guò)程中，SOHLH1與SOHLH2基因mRNA、蛋白的表達(dá)主要在原始卵母細(xì)胞中進(jìn)行，小鼠SOHLH1與SOHLH2基因的缺失會(huì)導(dǎo)致Nobox、Figla、Lhx8和Pou5f1基因的表達(dá)異常，也會(huì)導(dǎo)致Kit基因顯著下調(diào)，其作用方式是通過(guò)啟動(dòng)子上的E-box 區(qū)域[16]來(lái)實(shí)現(xiàn)，但對(duì)這2 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在卵子生成的上游基因的報(bào)道還比較少。精子生成過(guò)程中，這2 個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在未分化與分化的精原細(xì)胞中共表達(dá)，并以同二聚體和異二聚體的形式發(fā)揮作用，但在精原干細(xì)胞上不表達(dá)[15]。小鼠的SOHLH1與SOHLH2基因缺失會(huì)導(dǎo)致與減數(shù)分裂相關(guān)的基因表達(dá)，如Dmrtc2/Dmrt和Piwil1/Miwi，而且有Stra8（Stimulated By Retinoic Acid Gene 8）基因表達(dá)但無(wú)Kit表達(dá)的曲精細(xì)管數(shù)量增加，其他生殖細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)濃縮態(tài)的HORMAD1 螺紋狀染色體[17]，這是因?yàn)镾tra8基因調(diào)控著減數(shù)分裂的起始，HORMAD1 則為聯(lián)會(huì)復(fù)合物的關(guān)鍵成分[18-19]。

對(duì)SOHLH1與SOHLH2上游調(diào)控基因的研究發(fā)現(xiàn)，在精原細(xì)胞中，DMRT1（一種兩性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）直接調(diào)控SOHLH1與Stra8的表達(dá)，但是否調(diào)控SOHLH2仍未知[20]，在原始卵泡中SMAD1/5/8 參與SOHLH2與c-Kit基因[21]的調(diào)控。除了通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控SOHLH1與SOHLH2基 因 外，Pan 等[22]研 究表明，甲基化（Methylation）對(duì)生殖細(xì)胞特異性基因SOHLH2的表達(dá)亦發(fā)揮重要作用，由視黃酸（Retinoic Acid，RA）介導(dǎo)的MicroRNA 146 也參與SOHLH2基因[23]的調(diào)控。對(duì)SOHLH1與SOHLH2下游調(diào)控基因的研究發(fā)現(xiàn)，在精原細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，這2 種轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控Gfra1、Sox3、SOHLH1、SOHLH2與Kit基因[15]（圖5）。

Kit介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)PGCs 的增殖和生存極為重要，對(duì)雌雄生殖細(xì)胞的分化是必不可少的[24-25]。在胎兒的卵母細(xì)胞（Oocyte）中，Kit隨著減數(shù)分裂的啟動(dòng)而下調(diào)，卻在胎兒出生前后上調(diào)來(lái)控制卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。在雄性胎兒生殖細(xì)胞中，Kit在有絲分裂（Mitosis）受到阻遏時(shí)下調(diào)，一直持續(xù)到出生前3～4 d，此時(shí)Kit表達(dá)的抑制作用高度依賴(lài)于早幼粒細(xì)胞白血病鋅指基因（Promyelocytic Leukemia Zinc Finger，PLZF）活性[26]并且能阻遏精原干細(xì)胞的損耗[27-28]。而SOHLH1與SOHLH2是通過(guò)調(diào)控Kit啟動(dòng)子活性來(lái)控制生殖細(xì)胞分化的[14]，具體作用模式見(jiàn)圖6。

4 結(jié) 語(yǔ)

bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，特別是組織特異性bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞分化各階段發(fā)揮至關(guān)重要的作用。SOHLH1與SOHLH2作為睪丸、卵巢的特異性bHLH基因，在精子生成與卵子生成過(guò)程中是不可或缺的，這2 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)作用Kit基因啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控生殖細(xì)胞的發(fā)育。闡明其在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的作用機(jī)制，有利于揭示少精、無(wú)精及不孕不育等繁殖障礙問(wèn)題的深層原因；根據(jù)其組織特異性的特點(diǎn)，可以運(yùn)用生殖細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，制備動(dòng)物模型研究生殖細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育，或制備“生物導(dǎo)彈”，治療生殖類(lèi)疾病。