龔菊, 黃堅, 徐若欣, 吳云, 陳煒, 唐兆芳, 樂萍, 蘇州大學附屬第一醫(yī)院急診內科 江蘇省蘇州市 215006

龔菊, 常熟市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科 江蘇省常熟市 215500

滿益伍, 貴州省石阡縣醫(yī)院急診科 貴州省銅仁市 555100

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是一種急診常見的急腹癥, 近年來, 不健康的飲食和生活習慣, 使得AP發(fā)病率呈逐年上升, 嚴重危害廣大人民群眾生命健康.目前AP根據(jù)臨床指征[1,2], 可分三種類型: 輕度急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)、中度急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis, MSAP)以及重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP), 三類AP預后各不相同, 治療方案也有較大差異. MAP具有自限性, 預后好; 然而, SAP進展迅速, 死亡率高, 需及時收住ICU治療, 通過加強護理、臟器功能支持、液體復蘇以及消化道黏膜屏障保護等措施積極治療, 方能提高生存率; 因此, SAP臨床特征的早期識別, 尤為重要. 現(xiàn)認為AP發(fā)病機制主要涉及胰酶激活、炎癥反應、免疫失衡、微循環(huán)障礙等多方面, 其中免疫炎癥因子和相關免疫細胞至關重要, 由此, 炎癥細胞和新炎癥免疫因子檢測在AP鑒別診斷中呈現(xiàn)較高臨床價值.

本研究將以CD14和CD16兩個分子標記的外周血單核細胞分為兩個主要的亞群: CD14+CD16+單核細胞以及CD14+CD16-單核細胞, 且兩者在生物學功能方面具有較大的差異[3]. CD14+CD16+單核細胞成熟度較高, 且具有較強的抗原遞呈能力, 在炎癥性疾病中通常升高, 曾作為新生兒敗血癥的診斷指標[4]. B7-H2是新型共刺激分子, 在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要功能, 然而該分子在CD14+CD16+單核細胞表達情況尚未見報道. 本文旨在探討新型共刺激分子B7-H2在AP患者外周血CD14+CD16+單核細胞表達特征和臨床意義.

1 材料和方法

1.1 材料 經蘇州大學附屬第一院倫理委員會知情同意,依據(jù)2013年中國急性胰腺炎診治指南[1], 選擇蘇州大學附一院急診住院2016-01/2017-12發(fā)病24 h內的AP患者63例, 52.60歲±12.21歲, 男37人, 女26人. 其中MAP患者25例(52.24歲±12.34歲; 男14人, 女11人); MSAP患者為20例(52.61歲±13.45歲; 男12人, 女8人); 以及SAP患者為18例(53.11歲±11.25歲; 男11人, 女7人). 按病因分類,包括膽源性胰腺炎患者29例(MAP, MSAP以及SAP分別為12例, 9例以及8例); 酒精性胰腺炎11例(MAP, MSAP以及SAP分別為5例, 4例以及2例); 高脂性患者9例(MAP, MSAP以及SAP分別為3例, 3例以及3例); 暴飲暴食患者7例(MAP, MSAP以及SAP分別為2例, 2例以及3例)以及其他類型患者7例(MAP, MSAP以及SAP分別為3例, 2例以及2例). 同時, 收集健康體檢者20例作為對照組, 年齡范圍為51.3±14.2歲, 其中男性11例, 女性9例.所有受試者均除外傳染病、腫瘤、自身免疫病、血液病等疾病. 本研究通過本院倫理委員會批準[2017倫審(申報)批第0056號], 并且所有研究對象均簽署知情同意書.

1.2 方法

1.2.1 標本收集與處理: 分別于發(fā)病24 h、48 h以及72 h收集AP患者外周靜脈血, 并以蘇州大學附屬第一醫(yī)院體檢中心健康人群外周靜脈全血作為對照組(healthy control, HC). 采集標本均室溫保存, 并在6 h內開始檢測.

1.2.2 流式檢測: 儀器與材料: CytomicsTM FC 500流式細胞儀(德國); 抗體來自Biolegend公司(美國). 檢測方法: 靜脈外周血標本與anti-CD14抗體(PC5標記)、anti-CD16抗體(FITC標記)聯(lián)合B7-H2抗體(PE標記)或同型對照(PE標記), 冰上孵育反應30 min后, 加入紅細胞裂解液(Biolegend, 美國)1ml, 37 ℃溫育震蕩反應5-10 min至反應體系清澈透明; 加入2 mL PBS充分洗滌, 去除細胞碎片以及未結合的游離抗體; 以CD14+CD16+組合圈門,檢測分析CD14+CD16+細胞亞群上B7-H2表達情況. 所購抗體均來自Biolegend公司(美國).

統(tǒng)計學處理計量資料均進行正態(tài)分布檢驗, 以mean±SD表示; 兩組均數(shù)比較采用完全隨機設計t檢驗; 多組均數(shù)比較采用one-way ANOVA及LSDt檢驗;P＜0.05為有統(tǒng)計學意義, 所有檢驗均為雙側, 統(tǒng)計軟件為IBM SPSS Statistics 21.

2 結果

2.1 AP患者CD14+CD16+細胞膜B7-H2的表達 健康組CD14+CD16+細胞膜B7-H2幾乎不表達, AP組發(fā)病24 h CD14+CD16+細胞膜B7-H2出現(xiàn)異常高表達(P＜0.001);流式檢測AP和健康對照外周血CD14+CD16+細胞膜上B7-H2表達情況, AP患者(n= 63)以及健康對照(n= 20)外周血CD14+CD16+細胞膜上B7-H2水平統(tǒng)計圖, 每一個dot代表一個case, 數(shù)據(jù)表示為Mean±SE, 統(tǒng)計學方法為unpairedttest. AP患者組以及健康組對比(267.29±104.02, 8.06±3.60;t= 11.10,P＜0.001)(圖1).

2.2 CD14+CD16+和CD14+CD16-細胞膜B7-H2在不同程度AP患者中的表達 分析發(fā)現(xiàn), SAP組CD14+CD16+和CD14+CD16-細胞mB7-H2表達(373.30±89.72和78.62±13.05)最高, MSAP組(279.55±76.95/44.92±12.44)其次, 均高于MAP組(181.15±35.75/23.32±4.28), 各組兩兩比較差異有顯著性(P＜0.01)(表1、表2), 并且發(fā)現(xiàn)AP各組mB7-H2在CD14+CD16+細胞膜上表達明顯高于CD14+CD16-細胞膜上表達(P＜0.01).

表1 不同時間點急性胰腺炎各組外周血CD14+CD16+細胞膜B7-H2值的比較

表2 不同時間點急性胰腺炎各組外周血CD14+CD16-細胞膜B7-H2值的比較

圖1 急性胰腺炎和健康組外周血CD14+CD16+細胞膜上B7-H2表達分析. AP: 急性胰腺炎; HC: 健康組.

2.3 不同時間點AP患者血清中B7-H2的差異表達MAP組、MSAP組發(fā)病24 h、48 h、72 h CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細胞膜B7-H2動態(tài)表達差異無顯著性(P＞0.05); 然而, SAP組無論CD14+CD16+還是CD14+CD16-細胞膜B7-H2表達24 h、48 h、72 h均呈明顯上升趨勢, CD14+CD16+細胞膜B7-H2在不同時間點表達結果分別為373.30±89.72、480.49±103.85、641.01±137.00(P＜0.05), CD14+CD16-細胞膜B7-H2分別為78.62±13.05、90.07±12.24、119.41±15.31(P＜0.05).

3 討論

AP發(fā)病機制尚不十分明確. 研究顯示, 其發(fā)病始于胰腺損傷胰酶激活, 繼發(fā)炎癥反應, 從局部適度炎癥因子釋放, 機體保護性反應, 演變?yōu)槭Э匮装Y細胞激活連鎖反應, 炎癥介質“呈瀑布樣”釋放, 導致全身炎癥反應綜合征(systemic inflammation response syndrome, SIRS),機體損害, 最終免疫功能紊亂以及代償性抗炎反應綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS), 引發(fā)多器官功能障礙, 為AP死亡的主要原因.當SIRS和CARS同時并存又相互加強, 則產生對機體更嚴重的損傷, 導致炎癥反應和免疫功能更嚴重障礙, 稱為混合型抗炎反應綜合征[5]. 因此, 炎癥細胞與炎癥因子所誘導的免疫功能紊亂失衡, 直接與AP嚴重程度相關聯(lián), 決定患者預后[6].

單核細胞是一群可塑性極強的髓源性細胞, 在不同病理條件下可以分化為不同的亞群. CD14+CD16+單核細胞群體是一群新鑒定的單核細胞亞群[3]. 該群細胞主要表現(xiàn)為在炎癥刺激下可以釋放當量的腫瘤壞死因子-α,而較少產生白介素-10, 因此該群細胞被稱為促炎反應性單核細胞[4]. 既往研究中發(fā)現(xiàn)[7,8], 該群細胞在感染和炎性疾病中均大量增加, 并且發(fā)揮著重要的生物學功能.

共刺激分子是一群重要的免疫調節(jié)分子, 主要表達在樹突細胞、B細胞以及單核巨噬細胞等抗原遞呈細胞上, 其相應的受體集中表達于T淋巴細胞. 共刺激分子作為第二信號, 在介導抗原遞呈細胞刺激T細胞免疫應答中發(fā)揮著關鍵的作用, 其直接決定了免疫應答的方向和強度. B7-H2是共刺激分子家族新成員[9], 其與配體GL50結合在介導免疫應答中發(fā)揮著重要作用, 特別是在炎性疾病中. 然而, 該分子在CD14+CD16+單核細胞上的表達特征并不清楚. 本論文以急性胰腺炎患者為研究對象, 通過比較分析, 發(fā)現(xiàn)B7-H2在CD14+CD16+單核表達強度與AP疾病進展和分型相關.

關于B7-H2在急性胰腺炎患者體內的表達, 本研究團隊曾率先報道[10]sB7-H2在AP患者血清中表達量明顯增加, 且與AP的嚴重程度呈正相關, 由此推測B7-H2可能參與AP的發(fā)生發(fā)展. 為證實此推論, 本研究團隊進一步檢測AP患者外周靜脈血CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細胞膜B7-H2表達, 結果顯示AP發(fā)病24 h CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細胞膜B7-H2 表達明顯升高, 健康組幾乎不表達; CD14+CD16+和CD14+CD16-細胞mB7-H2表達, SAP組表達最高, 其次MSAP組, 均高于MAP組; 動態(tài)觀察24 h、48 h、72 h B7-H2表達, ,MAP組、MSAP組發(fā)病無顯著差異, 而SAP組呈明顯上升趨勢; 由此, 可以看出CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細胞膜B7-H2表達, 不僅和炎癥相關, 而且和AP早期嚴重程度密切相關, 與較前研究[10]相一致, 特別是SAP患者B7-H2異常動態(tài)增高, 可能預示全身炎癥反應SIRS加重, 炎癥因子瀑布樣釋放, 導致免疫紊亂. AP各組B7-H2在CD14+CD16+細胞膜上表達均高于CD14+CD16-細胞膜, 說明CD14+CD16+細胞在AP發(fā)病過程中更為活躍[7,8].

綜上所述, 本研究結果顯示, B7-H2分子在AP患者CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細胞膜上呈高表達, 并且與AP嚴重程度和進展相關, 其在CD14+CD16+細胞表面表達更為活躍. 但關于其具體調節(jié)機制仍需進一步探索, 可為進一步認識AP免疫應答和失衡提供新線索, 為AP精準靶向治療提供參考.

文章亮點

實驗背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)發(fā)病率逐年升高, 不同分型預后不同, 嚴重患者死亡率很高. 目前AP發(fā)病機制尚未完全闡明, B7-H2是新型共刺激分子, 在免疫調節(jié)中起重要作用, 本研究試圖尋找B7-H2在AP發(fā)生及發(fā)展中的異常表達, 揭示其潛在作用機制, 為臨床研發(fā)治療藥物或制定治療方案提供依據(jù).

實驗動機

本研究主題是揭示新型共刺激分子B7-H2在AP患者單核細胞CD14+CD16+上的表達差異. 擬解決的問題是揭示B7-H2與AP發(fā)生及發(fā)展的關系, 為進一步闡明AP免疫應答和炎癥反應致病機制提供新方向. 為AP精準治療尋找新靶點提供理論依據(jù).

實驗目標

本研究主要目標是揭示在單核細胞表面表達的膜性B7-H2信號潛在的誘導細胞免疫的機制. 為下一步研究其與預后相關性, 以及動物實驗奠定基礎. 為臨床提高AP治療效果提供參考.

實驗方法

本研究收集AP患者外周靜脈血, 利用流式檢測方法,檢測分析單核細胞CD14+CD16+、CD14+CD16-細胞亞群上B7-H2的表達情況. 首次驗證了新型共刺激分子B7-H2在單核細胞CD14+CD16+表面的表達.

實驗結果

本研究證實AP患者單核細胞CD14+CD16+表面B7-H2的表達升高; 重度AP患者CD14+CD16+、CD14+CD16-表面B7-H2的表達較中度AP、輕度AP更高, 并且72 h內, 表達進行性升高.

實驗結論

本研究在B7-H2在免疫應答中發(fā)揮重要作用的基礎上,首次驗證了其在AP患者CD14+CD16+、CD14+CD16-單核細胞上的高表達; 首次提出了該新型共刺激分子在AP患者發(fā)病機制、免疫調節(jié)中的作用假設; 為B7-H2與AP致病機制的細胞學基礎提供新理論; 為AP精準靶向治療提供新依據(jù).

展望前景

該研究需使用新鮮血標本, 以避免影響細胞表面分子和抗體的結合; 未來新型共刺激分子B7-H2有望成為治療的新靶點; 但需進一步實驗驗證.