龐亮 胡鐵良

天津市職業(yè)病防治院，天津市工人醫(yī)院泌尿外科 300011

0 引 言

腎細胞癌（renal cell carcinoma, RCC）是一種高度侵襲性和化療耐受性的疾病，由于其對放療的反應也很差，因此通常需通過手術切除來治療[1-2]。重要的是，治療后超過30%的患者局部RCC 復發(fā)或轉移[3]。即使在被認為可通過根治性腎切除術治愈的RCC 病例中，手術后5～10年仍可發(fā)生遠處轉移[4]。在過去的幾十年中，使用細胞因子的非特異性免疫療法已廣泛用于治療轉移性RCC，但由于其在提高患者中位生存率方面取得的成功有限，現(xiàn)在正逐漸被靶向免疫療法取代[5]。目前，在臨床實踐中常規(guī)使用的RCC 靶向療法，如免疫檢查點抑制劑、mTOR 抑制劑或VEGF 酪氨酸激酶抑制劑，但尚未使用預測性生物標志物來指導這些靶向療法的選擇[6]。在這種情況下，迫切需要可靠的RCC 生物標志物，以實現(xiàn)早期診斷、預后和監(jiān)測治療效果以及疾病的潛在復發(fā)。

近些年，液體活檢技術發(fā)展迅猛，如：循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）和無細胞核酸（即循環(huán)無細胞DNA），循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA），循環(huán)無細胞RNA 或細胞外囊泡，已成為監(jiān)測癌癥患者（包括RCC）疾病狀態(tài)的潛在工具，并受到極大關注[7]。本綜述重點對ctDNA 在RCC診療中的應用進行綜述。

1 ctDNA 分析概述

無組織的DNA 在某些情況下可在血液中釋放，如在炎癥狀態(tài)或懷孕時。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，癌癥患者的ctDNA 濃度更高[8]。目前尚不清楚ctDNA 如何釋放到血液中，但先前的研究表明其來源可能是壞死和/或凋亡引起的細胞裂解[9]。它是腫瘤特異性的，并提供有關腫瘤細胞片段化DNA及其特異性突變的分子線索[10]。隨著高通量測序和液體活檢技術的迅速發(fā)展，血漿中存在的ctDNA 已逐漸成為組織的替代品[11]。ctDNA 中的全基因組拷貝數(shù)的不穩(wěn)定性分析提供了一種合適的方法，從而可量化染色體不穩(wěn)定性并預測癌癥的治療反應[12-13]。為實現(xiàn)RCC 的早期診斷、預后和監(jiān)測治療效果以及疾病的復發(fā)提供了有力的支持。

2 ctDNA 的定性分析

Pal 等[14]分析了 220 例轉移 RCC（metastatic RCC,mRCC）患者的ctDNA。有79%的患者檢測到基因改變，其中最常見的是 TP53（35%）、VHL（23%）、EGFR（17%）、NF1（16%）和 ARID1A（12%），并以單核苷酸變異為主。他們還比較了在一線藥物治療的患者（舒尼替尼和帕唑帕尼）和二線藥物治療的患者（尼古盧單抗，依維莫司，阿昔替尼和卡博替尼）的ctDNA 分析中檢測到的基因改變。并注意到TP53（49%vs 24%，P=0.02）、NF1（20%vs 3%，P=0.01）發(fā)生了改變。這些發(fā)現(xiàn)提出了這樣的假設，即某些基因改變可能是治療中選擇性壓力的結果，并且可能在治療耐藥性中起作用。

在已知與治療敏感性相關的分子途徑中尋找與指導治療決策相關的特定突變。對依維莫司的敏感性似乎與TSC1/TSC2/mTOR 改變有關。不論組織學如何，在有臨床獲益的患者中和非臨床獲益的患者中均發(fā)現(xiàn)了這些突變的發(fā)生[15]。Voss 等[16]在5 例mRCC 接受mTOR 抑制劑治療的患者中，發(fā)現(xiàn)在TSC1 和mTOR 中存在對mTOR 信號具有激活作用的基因組改變，此為異常的治療反應提供了合理的解釋。TSC1 和TSC2 可能被篩選為在以VEGF 為靶點治療的RCC 患者中依維莫司反應的預測生物標志物。

已鑒定了與侵襲性腫瘤行為相關的特定突變或一組突變，如 SETD2（ccRCC 的 15%）、PBRM1（40%）、BAP1（15%）、KDM5C（7%）、MTOR（5%～6%），可以考慮未來使用液體活檢來指導治療相關的mRCC[17-19]。乳頭狀 1 型 RCC 與 MET 基因改變有關，而乳頭狀2 型RCC 的特征在于CDKN2A、SETD2、NF2、CUL3，TERT 突變[20]?；加羞z傳性平滑肌瘤和RCC 綜合征的富馬酸水合酶基因突變的患者有可能發(fā)生2 型乳頭狀RCC[21]。

3 ctDNA 在局限性腎細胞癌中的應用

盡管25%的RCC 患者在就診時已出現(xiàn)轉移，但另外20%～40%的局限性RCC 患者最終會發(fā)展成mRCC 患者[1,22]。RCC 中轉移的時間和位置很難預測，這使得監(jiān)測變得困難。早期發(fā)現(xiàn)轉移性疾病可能會改善臨床結局。ctDNA 有潛力作為腎切除術后局限性RCC 患者的監(jiān)測生物標志物。Al-Qassab 等[23]研究了一些預后基因以及RCC 中其他常見突變的基因，從而創(chuàng)建了一個由14 個基因組成的小組。在此項針對30 例準備腎切除術的RCC 患者的研究中，ctDNA 二代測序（next-generation sequencing, NGS）被用于檢測這14 個常見的突變基因。30 名術前RCC 患者中有20 名在所有檢測基因中均具有可檢出基因改變。即使是早期疾病且腫瘤大小僅為1.1×0.7×0.5 cm3的患者，也可檢測到ctDNA 突變。這表明即使在局限性RCC 中低腫瘤負擔的患者也可定量檢測到ctDNA。

另一項研究使用實時定量PCR 來檢測92 例不同階段的透明細胞RCC 患者的ctDNA 水平[24]。研究者發(fā)現(xiàn)，mRCC 患者的ctDNA 高于局限性RCC（6.04 vs 5.29，P=0.017）。研究還表明，RCC 的復發(fā)具有較高的ctDNA 水平（P=0.024）。這些研究結果表明，可按設定的時間間隔定期監(jiān)測ctDNA，以監(jiān)測疾病的復發(fā)情況。ctDNA 的使用可減少與篩查CT 掃描相關的潛在危害，包括造影劑腎病和放射線照射。

在局限性RCC 中，少數(shù)研究已報道了ctDNA 在疾病監(jiān)測中的新用途。Hauser 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與健康患者相比，RCC 中ctDNA 的CPG 島超甲基化很常見，并且可作為RCC 初始診斷的潛在生物標志物。在另一項研究中，研究人員分析了整個RCC 各階段的基因組和線粒體ctDNA 濃度。他們使用基因組和線粒體ctDNA 的組合，為RCC 開發(fā)了新的診斷和預后模型[26]。當然，這兩種使用ctDNA 的新技術都需在更大的隊列中進行進一步驗證，以更清楚地描述其臨床用途。

4 ctDNA 在轉移性腎細胞癌中的應用

4.1 轉移性腎癌中ctDNA 的突變

對于mRCC，臨床實踐中常規(guī)使用靶向療法，如VEGF 酪氨酸激酶抑制劑或mTOR 抑制劑，但尚沒有預測性的生物標志物指導這些靶向療法的選擇。隨著液體活檢技術的發(fā)展，mRCC 中的ctDNA 可作為免疫治療反應的生物標記物。一項對220 名mRCC患者的大型研究首次評估了mRCC 中ctDNA 的突變情況[14]。在該研究中，檢測了ctDNA 中的基因改變。在評估的220 名患者中，在78.6%的患者中至少檢測到一種基因改變，表明mRCC 脫落了可檢測量的ctDNA。在ctDNA 中檢測到最常見的基因改變是TP53（35%）、VHL（23%）、EGFR（17%）、NF1（16%）和ARID1A（12%）。與之前TCGA 中組織NGS 檢測的RCC 研究對照相比，此研究RCC 中檢測到的基因改變的情況相似；但是，兩項研究之間基因改變的頻率有所不同。如，在TCGA 研究中，ctDNA 隊列中只有不到3%的患者有TP53 改變，而此研究ctDNA隊列中有35%的患者有TP53 改變[27]。腫瘤組織和ctDNA 的NGS 研究之間的基因改變頻率差異可能是由于患者人群的差異（即局限性與轉移）所致。這項研究表明ctDNA 的NGS 可提供mRCC 中存在的突變的特征。

由于ctDNA NGS 能夠檢測多線治療后的變化情況，因此ctDNA 可用于符合生物標志物指導臨床試驗條件的患者。生物標記物指導的臨床試驗已在mRCC 中使用，并且有望應用更加普遍。如，MET 的改變在1 型乳頭狀RCC 中很常見[20]。在沃利替尼用于pRCC 的Ⅱ期臨床試驗中，MET 引起的乳頭狀RCC 對治療表現(xiàn)出強烈的反應，而非MET 引起的乳頭狀 RCC 缺沒有反應（P=0.002）[28]，因此 ctDNA 可用于此生物標記物指導的臨床試驗中。

腫瘤組織和ctDNA NGS 檢測到的基因改變的比較來自于對19 例mRCC 患者的研究[29]。當分析兩個測試中檢測到的基因改變時，組織和ctDNA 之間檢測到的基因改變的中位數(shù)相似（中位數(shù)3.0 vs 1.0，P=0.14）；但是，兩個測試之間的一致性比率僅為8.6%。該研究的臨床實用性受到組織與ctDNA NGS 之間檢測時間的限制。在其他惡性腫瘤的研究中，研究者控制了兩次檢查之間的時間，結果所報告的一致率更高[30]。然而，ctDNA 和組織NGS 之間的顯著不一致也可能反映了患者體內(nèi)腫瘤的異質(zhì)性。2012年，對4 名mRCC 患者的研究中，同一患者多個部位的活檢顯示體細胞改變具有明顯的空間異質(zhì)性[31]。ctDNA 可能比組織的NGS 更準確地反映了患者體內(nèi)腫瘤的異質(zhì)性，并且可能更準確地識別了突變。這將使ctDNA 成為鑒定有新的轉移的理想測試。

4.2 ctDNA 與影像學

在大多數(shù)臨床情況下，每3 個月使用CT 監(jiān)測mRCC 患者的胸部/腹部/骨盆。反復進行CT 掃描既耗時、成本高昂，又使癌癥患者遭受高劑量的輻射。ctDNA 有潛力替代mRCC 中的這些檢查。在最近的一項針對34 例mRCC 患者的研究中，可檢測到ctDNA 的患者比未檢測到ctDNA 的患者具有更高的影像學負擔（P=0.01）[32]。盡管這些發(fā)現(xiàn)表明ctDNA具有補充或替代mRCC 患者頻繁進行CT 掃描的能力，但這些結果來自一項小型回顧性研究，尚需在較大的人群中進行進一步評估。

4.3 ctDNA 與腫瘤突變負荷

納武單抗（Nivolumab）是針對PD-1 的單克隆抗體，目前已批準用于mRCC 的挽救性治療[33]。預計更多的免疫檢查點抑制劑將在不久的將來獲得治療mRCC 的批準。最近的研究顯示，與單獨使用舒尼替尼進行mRCC 的一線治療相比，納武單抗加伊匹單抗（ipilimumab）的組合改善了總生存期（OS）[34]。而且，一線研究中正在研究免疫檢查點抑制劑和靶向治療的許多組合。臨床上并沒有使用可預測對免疫檢查點抑制劑有較好應答的生物標志物，但它們可幫助mRCC 等惡性腫瘤制定個性化的治療順序。ctDNA 已顯示出作為免疫檢查點抑制劑的預測生物標記物的潛力。

納武單抗最近被批準用于治療任何具有錯配修復缺陷的癌癥[35]。具有錯配修復缺陷的腫瘤具有異常高的腫瘤突變負荷。最近的一項研究表明，ctDNA 可以替代腫瘤突變負荷[36]。在對69 名患者的實體瘤研究中，包括3 名mRCC 的患者，均接受了免疫檢查點抑制劑（定義為≥6 個基因改變ctDNA）治療。預測客觀緩解率（40.9%vs 15.9%，P=0.025）和無進展生存（2.85 vs 2.19 m，HR=0.59，P=0.025）改善。這些結果清楚地表明，ctDNA 中更多的基因改變可替代高腫瘤突變負荷，并且可預測對免疫檢查點抑制劑的反應。

有一項獨特的病例報告證明了ctDNA 作為mRCC對免疫療法反應的預測性生物標志物的價值[37]。一名44 歲的男子被診斷出患有mRCC，他的腦部發(fā)生孤立性轉移。依次用大劑量白介素-2、帕唑帕尼、貝伐單抗、尼古魯單抗加依匹莫單抗和卡博替尼治療?？ú┨婺嶂委熀?，評估了ctDNA NGS 并顯示出大量的基因改變；而后又使用了納武單抗，之后的ctDNA NGS 沒有可檢測到的基因改變。這個案例說明了ctDNA 在mRCC 治療中的兩個潛在作用：第一，與先前討論的研究一致，ctDNA 中的大量基因改變可替代高腫瘤突變負荷，并預測對免疫療法的反應；第二，開始治療后在ctDNA 中檢測到的基因改變數(shù)量可能反映了治療反應。這種觀察尚需在更大的隊列中進一步驗證。

5 新技術

盡管液體活檢在臨床上日益受到重視，但由于目前ctDNA 檢測方法的局限性，某些設置（如癌癥篩查）無法從這種無創(chuàng)技術中受益。尤其是ccfDNA和ctDNA 之間的區(qū)別需要一種高度敏感的技術。為此，加拿大的一個小組開發(fā)了一種新的基于免疫沉淀的方案，以分析少量ccfDNA 的甲基化。他們發(fā)現(xiàn)，通過低成本、高效率的方法，可檢測癌癥特異性差異甲基化區(qū)域（DMR），從而可提高ctDNA 檢測的靈敏度[38]。

6 結語與展望

液體活檢在臨床中的應用為新的研究領域鋪平了道路。目前雖然可以使用組織和ctDNA 進行預測性標志物的鑒定、預后和分子亞型的分類，但隨時間推移追蹤克隆的改變，及早發(fā)現(xiàn)耐藥機制，監(jiān)測治療反應，檢測復發(fā)卻僅能以無創(chuàng)方式的液體活檢才有可能。

目前正在研究實施液體活檢的許多問題和挑戰(zhàn)，以及新興的液體活檢分析物（如細胞外囊泡、循環(huán)無細胞RNA、支鏈氨基酸、蛋白質(zhì)、腫瘤相關的血小板），采用開發(fā)綜合的多維分析方法對于解決這些挑戰(zhàn)至關重要。

ctDNA 的NGS 檢測是一項新穎的技術，它有可能通過提供腫瘤突變情況來改變臨床實踐。在局限性RCC 中，ctDNA 有潛力作為腎切除術后疾病復發(fā)的篩查工具。在mRCC 中，ctDNA 有望作為對免疫治療反應的預測性生物標志物。此外，ctDNA 可為全身性治療后的評估提供支持。在RCC 的所有階段中，液體活檢對患者都具吸引力，因為它們均屬無創(chuàng)檢查，且可連續(xù)重復進行而不會對患者造成重大傷害。目前，已經(jīng)有越來越多ctDNA 的相關研究應用于臨床試驗[39-42]，而隨著技術的不斷革新，更加準確且穩(wěn)定的檢測方法將被不斷的開發(fā)出來，并進入臨床試驗驗證。相信未來，ctDNA 有可能影響腎細胞癌的診斷和治療，其臨床應用前景將更加廣闊。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突