王譯晗 王佳媛 焦遞進 馬旭

沈陽市骨科醫(yī)院重點實驗室110044

0 引 言

據(jù)報道，超過90%的椎間盤退變（intervertebral disc degeneration）患者年齡在50 歲以上[1]。盡管椎間盤退變屬于自然衰老過程，但仍有部分患者會出現(xiàn)由椎間盤退變引起的癥狀性神經(jīng)根壓迫及慢性背痛[2-3]。然而，藥物及物理療法等保守治療措施并不能解決椎間盤退變的根本原因，也無法減緩疾病的自然進展。當(dāng)癥狀逐漸加劇的患者對保守治療措施無反應(yīng)時，則需進行手術(shù)治療。目前，手術(shù)治療方法包括椎間盤切除術(shù)及放置骨間融合的椎間植骨等。但因關(guān)節(jié)假體所致的鄰近節(jié)段疾病，進而導(dǎo)致癥狀復(fù)發(fā)需再次手術(shù)的病例屢見報道[4-5]，且上述外科手術(shù)干預(yù)存在一定的潛在并發(fā)癥。隨著人們在分子和細胞水平上對椎間盤特征理解的逐漸深入，細胞療法作為椎間盤退變的治療方法，已逐漸引起了人們的關(guān)注。

細胞療法在醫(yī)療領(lǐng)域被快速推進，其治療領(lǐng)域包括自身免疫性疾病、心肌梗死、腦缺血、肝硬化及脊髓損傷等多種疾病[6-7]。目前，已有多種類型的細胞經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)途徑用于椎間盤退變的治療中，適宜的細胞來源、細胞載體及椎間盤內(nèi)微環(huán)境條件等因素對于椎間盤退變的治療起到關(guān)鍵作用。本文對這些內(nèi)容進行了概述，討論了不同的細胞類型及條件用于椎間盤再生治療的現(xiàn)狀及發(fā)展。

1 椎間盤退變

椎間盤退行性疾病是腰痛的主要原因，通常隨著年齡的增長而發(fā)生。椎間盤是由3 種特殊組織組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)：外周纖維環(huán)、中央髓核及分離椎體的透明軟骨終板[8]。椎間盤是體內(nèi)最大的無血管組織，依賴于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣通過鄰近終板的濃度梯度擴散，以維持髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）的活力[9]。椎間盤退變是由于連接相鄰椎骨的結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致椎間盤完整性喪失，從而影響椎間盤的減震能力。在此過程中，髓核蛋白多糖含量降低引起凝膠樣核基質(zhì)逐漸脫水，并被纖維軟骨取代，進而椎間盤形態(tài)發(fā)生改變，椎間盤高度降低，造成脊柱不穩(wěn)定并對脊柱的后部元件產(chǎn)生更大壓力[10]。另外，椎間盤退變的形態(tài)學(xué)改變還與合成代謝和分解代謝過程之間的代謝失衡有關(guān)，該過程受多種因素調(diào)節(jié)，如合成代謝生長因子胰島素樣生長因子-1、轉(zhuǎn)化生長因子β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及分解代謝酶等，均可導(dǎo)致NPCs 的功能發(fā)生變化。而椎間盤固有的無血管性、隔離性和低代謝活性使其在損傷和變性后無法進行自我修復(fù)[11]。治療或預(yù)防椎間盤退變的方法在于恢復(fù)椎間盤合成細胞外基質(zhì)的能力，以重建椎間盤水合性及髓核黏彈性的特征，從而恢復(fù)椎間盤的生物力學(xué)特性。細胞療法可通過刺激細胞外基質(zhì)的合成，以及通過細胞與細胞相互作用等途徑促進椎間盤的修復(fù)再生。

2 細胞療法的機制

2.1 替代軟骨細胞

移植細胞可能主要通過兩種機制傳遞其再生效應(yīng)。第一種機制是細胞在椎間盤中存活、增殖并分化，充當(dāng)軟骨細胞樣椎間盤細胞。這些移植細胞可產(chǎn)生蛋白多糖和膠原，從而彌補椎體退變的缺陷并恢復(fù)椎間盤的結(jié)構(gòu)和功能。軟骨細胞可直接通過替換耗盡的功能性軟骨細胞群來拯救退化的椎間盤，然而對于未分化的干細胞移植如間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）或間質(zhì)前體細胞（mesenchymal precursor cells，MPCs）等，移植細胞必須首先在椎間盤內(nèi)經(jīng)歷軟骨形成的分化，繼而發(fā)揮替代作用，在軟骨形成條件下MSCs 或MPCs 等可分化成類似于NPCs 的軟骨細胞樣細胞[12]。另外，Richardson 等[13]的研究結(jié)果表明，無論細胞比例如何，當(dāng)NPCs 和MSCs 無接觸培養(yǎng)時，兩種細胞中髓核標記基因的表達均無明顯變化；當(dāng)NPCs 和MSCs共培養(yǎng)時，MSCs 中髓核標記基因表達顯著增加。因此，共培養(yǎng)是產(chǎn)生大量分化細胞的可行方法。

2.2 旁分泌

移植細胞傳遞其再生效應(yīng)的第二種可能機制是旁分泌效應(yīng)，即移植細胞通過釋放可溶性營養(yǎng)因子發(fā)揮作用，這些因子可啟動或刺激駐留的椎間盤細胞產(chǎn)生椎間盤基質(zhì)。文獻報道，MSCs 和MPCs 能分泌抗炎細胞因子和生長因子[14]，這些因子可增強NPCs 合成新基質(zhì)，并抑制由機械介導(dǎo)的椎間盤損傷引發(fā)的分解代謝事件。Yang 等[15]報道了自體MSCs移植可抑制細胞凋亡，減緩椎間盤高度指數(shù)的降低速度，促進椎間盤基質(zhì)的修復(fù)，進一步證實了旁分泌作用機制的理論。此外，外泌體作為細胞-細胞通訊中的重要旁分泌機制一直備受關(guān)注。Lu 等[16]發(fā)現(xiàn)，外泌體是自體骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs）和 NPCs 之間信息交換的重要載體，NPCs 和BMSCs 均分泌外泌體，NPCs 衍生的外泌體可促進BMSCs 遷移并誘導(dǎo)其分化成髓核樣表型，而BMSCs 衍生的外泌體可促進退變NPCs 增殖并合成健康的細胞外基質(zhì)。Cheng 等[17]則發(fā)現(xiàn)，BMSCs 衍生的外泌體還可阻止NPCs 進行性凋亡過程，將外泌體miR-21 轉(zhuǎn)入NPCs，可抑制磷脂酶和張力蛋白同源物，激活凋亡NPCs中的PI3K/Akt 途徑，從而減輕腫瘤壞死因子-α 誘導(dǎo)的NPCs 凋亡。

3 細胞來源

細胞療法可有效針對特定的功能障礙進行治療，而選擇適宜的細胞來源是椎間盤細胞治療成功的必要條件。植入的細胞需能存活并產(chǎn)生足夠質(zhì)量的組織，以滿足椎間盤再生的需求。目前，多數(shù)研究以髓核作為椎間盤再生或防止椎間盤高度進一步丟失的靶點。用于治療椎間盤退變的細胞包括NPCs[18]或其他具有盤狀潛能的細胞，如軟骨細胞[19]和MSCs[20]等。

3.1 軟骨細胞

軟骨細胞在表型上與NPCs 最為相似，均存在于低細胞、無血管和無神經(jīng)支配的承重組織中[21]，且具有相似的基因表達模式，如Y 框蛋白9[22]和基質(zhì)金屬蛋白酶[23]等。同時，兩者均能產(chǎn)生豐富的細胞外基質(zhì)，富含聚蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白（type Ⅱcollagen，COL2）[24]。因此，關(guān)節(jié)[25]、耳廓[26]、鼻[27]等組織的軟骨細胞被認為是椎間盤細胞治療的可靠來源。

Gorensek 等[26]使用耳廓軟骨細胞誘導(dǎo)兔髓核再生，結(jié)果證實植入軟骨細胞可存活并產(chǎn)生透明軟骨。Acosta 等[25]也發(fā)現(xiàn)豬同種異體幼年關(guān)節(jié)軟骨細胞可在新形成的組織中產(chǎn)生髓核樣組織再生。Gay等[27]將模擬退化的椎間盤生理條件下鼻軟骨細胞（nasal chondrocytes，NCs）的組織形成特性與MSCs和關(guān)節(jié)軟骨細胞（articular chondrocytes，ACs）進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs 在炎癥環(huán)境中糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）和 Col2 的積累明顯減少，NCs 在非酸性條件下可積累GAG 和Col2，而補充炎癥細胞因子或酸性環(huán)境對NCs 的影響程度低于ACs 或MSCs，表明在椎間盤炎癥環(huán)境中，移植NCs優(yōu)于移植 ACs 或 MSCs。Vedicherla 和 Buckley[28]比較了NCs 與ACs 作為椎間盤替代軟骨細胞來源的細胞產(chǎn)量，結(jié)果表明，在氧氣體積分數(shù)為5%條件下，NCs 仍可保持細胞的增殖能力，并可見大量硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycans，sGAG）和較少量膠原積累，同時在椎間盤樣微環(huán)境條件下培養(yǎng)時，NCs 的成骨和鈣化也受到了抑制。

3.2 干細胞

干細胞可通過細胞分裂進行自我更新，并可被誘導(dǎo)發(fā)育成不同的特化細胞。干細胞具有來源廣泛、免疫原性弱、易于外源基因轉(zhuǎn)染、可于宿主體內(nèi)長期存活、可跨胚層多向分化等優(yōu)勢，已在各種組織內(nèi)顯示出遷移和移植的能力，并通過多種機制對其他類型細胞發(fā)揮刺激作用。這些特征使干細胞成為椎間盤退變細胞療法更具吸引力的細胞來源。

動物體內(nèi)研究結(jié)果顯示，同種異體BMSCs 植入兔腰椎的髓核后24 周，在兔椎間盤組織切片中可檢測到BMSCs，表明移植的BMSCs 可存活并成功植入椎間盤組織，同時BMSCs 也是外源基因遞送至椎間盤的有效載體[29]。而體外研究結(jié)果證實，人NPCs 與人 BMSCs 以 75∶25（細胞數(shù)量比）共培養(yǎng)2 周，產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)最多；在BMSCs 和NPCs 共培養(yǎng)條件下，BMSCs 數(shù)量逐漸減少，而NPCs 數(shù)量逐漸增加，表明BMSCs 可能是通過促進NPCs 增殖起到椎間盤修復(fù)的作用，而非通過促進基質(zhì)形成發(fā)揮治療作用[30]。然而對于干細胞而言，尚存在分化不適當(dāng)?shù)葐栴}，阻礙了干細胞用于椎間盤退變的治療。例如BMSCs 可能會遵循成骨向分化途徑，Vadalà等[31]發(fā)現(xiàn)注射入兔椎間盤中的BMSCs 會導(dǎo)致后期的骨贅形成，表明該法可能會產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)。

3.3 NPCs

髓核退化是椎間盤退變的主要原因，針對NPCs的研究正在引起越來越多的關(guān)注。Iwashina 等[32]將人NPCs 移植入兔椎間盤退變模型，發(fā)現(xiàn)移植后4 周椎間盤高度明顯增高，移植后24 周NPCs 仍存在。Oehme 等[33]發(fā)現(xiàn)，移植的NPCs 在椎間盤內(nèi)可存活8 周至 8 個月，而 MSCs 的存活時間為 2 周至 24 周。Wang 等[34]將表達綠色熒光蛋白的大鼠NPCs 移植入退化的椎間盤中，并于體外將NPCs 與軟骨細胞和纖維環(huán)細胞（annulus fibrosus cells，AFCs）共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射NPCs 是通過抑制細胞凋亡和增加細胞外基質(zhì)來抑制椎間盤退變的發(fā)展，NPCs 可在體內(nèi)遷移至纖維環(huán)內(nèi)部，而體外NPCs 的遷移是由AFCs和軟骨細胞共同促進的。這些結(jié)果證實了移植入椎間盤內(nèi)的同種異體NPCs 的抗細胞凋亡作用和遷移能力。此外，由于髓核的營養(yǎng)供應(yīng)不足，低數(shù)量的細胞更有益于細胞的存活，可促使髓核產(chǎn)生最大限度的效應(yīng)；超過該效應(yīng)，增加的細胞無法存活，同時死亡細胞和廢物的積累反而會產(chǎn)生有害影響[35]。

4 椎間盤內(nèi)微環(huán)境條件

為了確保植入細胞的安全性及有效性，評估植入部位的微環(huán)境條件及其對植入細胞的影響十分重要。椎間盤內(nèi)的微環(huán)境條件，特別是退化盤的微環(huán)境條件，常不同于可用細胞源的自然環(huán)境，即不同于細胞的實驗室培養(yǎng)條件。在植入椎間盤之前，細胞群體的擴增方式可能會嚴重損害細胞的功能，甚至可能導(dǎo)致植入細胞的死亡[36]。椎間盤細胞需在具有足夠氧和葡萄糖的細胞外環(huán)境生長，且pH 不能為酸性。

上述研究結(jié)果表明，椎間盤內(nèi)嚴酷的微環(huán)境條件對植入細胞具有較大的挑戰(zhàn)性，在移植前對移植細胞進行預(yù)處理可克服這一難點。Wang 等[40]將大鼠ADMSCs 在軟骨形成條件培養(yǎng)基中預(yù)分化7～10 d，可促進ADMSCs 在椎間盤樣條件下的再生效果，表明預(yù)分化過程對椎間盤惡性環(huán)境中ADMSCs 的再生具有積極作用。

5 細胞載體

細胞療法治療椎間盤退變的成功與否還取決于移植細胞是否獲得有效的遞送。載體生物材料對于細胞的靶向遞送必不可少，可提供關(guān)鍵的生物物理和生物化學(xué)作用，促進細胞的分化。

Naqvi 和Buckley[30]評估了藻酸鹽和殼聚糖水凝膠對BMSCs 和NPCs 的影響。結(jié)果顯示，NPCs 在兩種水凝膠中均能保持較好的活力，而BMSCs 在殼聚糖水凝膠中活力降低；另外，與殼聚糖水凝膠相比，藻酸鹽水凝膠能更好地支持NPCs 和BMSCs 的sGAG 積累及 COL2 沉積。Vadalà 等[41]的研究結(jié)果證明懸浮的MSCs 容易滲入周圍的椎間盤中，從而導(dǎo)致骨贅形成。而支架在MSCs 移植中的應(yīng)用可降低細胞滲漏的風(fēng)險，對臨床應(yīng)用至關(guān)重要[42]。Bertram等[43]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞以懸液形式注射時，90%的細胞會發(fā)生泄漏，而通過與纖維蛋白膠共同給藥時，泄露率降至50%。Barczewska 等[44]研究了將懸浮于水凝膠中的MSCs 引入椎間盤的細胞遞送方法，發(fā)現(xiàn)水凝膠可模仿天然儲庫環(huán)境，為MSCs 的生長和分化提供支架，并為髓核的修復(fù)和再生提供條件。Bendtsen等[45]報道，懸浮于水凝膠中的MSCs 可維持血流量、椎骨體積以及椎體終板和軟骨下骨的滲透性長達3 個月之久。

6 結(jié) 語

由于椎間盤內(nèi)細胞丟失對人體造成的嚴重危害，新型椎間盤治療手段逐漸引起了人們的關(guān)注。盡管細胞療法的細胞來源廣泛且移植便捷，但退化細胞種群的次優(yōu)再生及細胞提取引發(fā)的疾病等使細胞療法受到了明顯限制。因此，還需進一步確定細胞的基本性質(zhì)、移植條件及其對人體的短期和長期毒性，細胞療法治療椎間盤退變才有望廣泛應(yīng)用于臨床實踐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突