廖致紅,代小麗，吳春鳳，劉志華，李麗敏，徐 鵬 綜述，沈開元審校

(廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣西柳州 545006)

基因治療指利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，使外源基因的產(chǎn)物補(bǔ)償基因缺陷或糾正基因異常，從而治療疾病的方法。外源基因?qū)氚屑?xì)胞的方法有很多，基因治療載體的研究從反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等病毒載體發(fā)展到如今的人工染色體載體、細(xì)菌載體、桿狀病毒等新的載體。但是實(shí)現(xiàn)外源基因長期穩(wěn)定的表達(dá)、靶向性的表達(dá)還需進(jìn)行更多的探索和研究[1]。本文對近年來重組桿狀病毒基因治療載體的研究以及其在癌癥基因治療中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)。

1 重組桿狀病毒及其表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒是一種環(huán)狀、閉合雙鏈DNA病毒，基因組大小為80～160 kb[2]，編碼90～180個(gè)蛋白，在已測序的桿狀病毒中發(fā)現(xiàn)31個(gè)核心基因[3]。根據(jù)包涵體的形態(tài)和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病理學(xué)特征，桿狀病毒分為核多角體病毒屬(NPV)和顆粒病毒屬(GV)[4]。

重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種利用桿狀病毒為載體，在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞或蟲體中表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由轉(zhuǎn)移載體、親本病毒和重組介質(zhì)3個(gè)部分組成，重組病毒的構(gòu)建過程如下：將目的基因克隆到轉(zhuǎn)移載體，將載體與親本病毒同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，目的基因通過同源重組替換桿狀病毒非必需片段形成重組病毒，病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制時(shí)，目的基因也得到表達(dá)[2]。該技術(shù)是一項(xiàng)成熟、安全、經(jīng)濟(jì)、高效的蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)。

2 重組桿狀病毒在癌癥基因治療中的應(yīng)用

根據(jù)治療基因進(jìn)入癌細(xì)胞后的不同效應(yīng)，將重組桿狀病毒介導(dǎo)的癌癥基因治療方法分為3種。第一種方法是治療基因進(jìn)入癌細(xì)胞能夠加強(qiáng)機(jī)體對惡性增生癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并清除癌細(xì)胞。其方法就是利用重組桿狀病毒將癌細(xì)胞特異性抗原導(dǎo)入機(jī)體，隨后激活機(jī)體自身的T淋巴細(xì)胞的識別作用，進(jìn)而清除癌細(xì)胞[5]。有研究者利用動物模型，通過重組桿狀病毒攜帶CD40配體和白細(xì)胞介素(IL)-15基因治療膀胱癌，發(fā)現(xiàn)兩種基因的導(dǎo)入可以顯著增加膀胱組織單核細(xì)胞，CD4+、CD8+和γδ T淋巴細(xì)胞的浸潤性，明顯延長動物的生存期(治療組>12個(gè)月，對照組<2個(gè)月)，且端粒反轉(zhuǎn)錄酶基因在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[6]。據(jù)此KIM等[7]構(gòu)建了包含端粒反轉(zhuǎn)錄酶基因的重組桿狀病毒載體，并以高劑量接種被植入膠質(zhì)瘤瘤體的小鼠，隨后在實(shí)驗(yàn)組小鼠的體內(nèi)觀察到大量分泌干擾素(IFN)-γ的T淋巴細(xì)胞，而且實(shí)驗(yàn)組小鼠自然殺傷(NK)細(xì)胞的活性也顯著高于對照組小鼠。重組桿狀病毒中載入IFN-β基因后轉(zhuǎn)導(dǎo)Lewis肺癌(LL)細(xì)胞可導(dǎo)致體外惡性表型減少，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)[8]。美國食品藥物監(jiān)督管理局(FDA)在2009年批準(zhǔn)的Cervarix疫苗也是利用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的攜帶人乳頭瘤病毒(HPV)16、18型L1蛋白的病毒樣顆粒[9]。這些研究結(jié)果表明，重組桿狀病毒能夠攜帶病毒抗原蛋白或腫瘤特異性蛋白基因，并在哺乳動物細(xì)胞成功表達(dá)，激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來消滅病毒或清除癌細(xì)胞。

第二種是將“自殺基因”導(dǎo)入癌細(xì)胞，以此實(shí)現(xiàn)治療癌癥的目的。WANG等[10]利用神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)白喉毒素A，聯(lián)合胞內(nèi)注射可以實(shí)現(xiàn)較高的治療有效率(96%)。利用重組桿狀病毒載體表達(dá)單純皰疹病毒胸苷激酶，其可在抗皰疹病毒藥物更昔洛韋存在的情況下，誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡，從而達(dá)到治療惡性膠質(zhì)瘤的目的[11]。

第三種方法是將正常基因?qū)氚┘?xì)胞中，以此來糾正癌基因或修復(fù)抑癌基因，阻止癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其死亡。2001年SONG等[12]運(yùn)用重組桿狀病毒攜帶人p53基因治療骨肉瘤，重新導(dǎo)入p53基因的細(xì)胞對化療藥物更敏感，因此聯(lián)合阿霉素，其治療有效率(95%)顯著高于單獨(dú)使用阿霉素(55%)，這種聯(lián)合治療方法為臨床應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。隨后一些組蛋白乙酰化酶抑制劑，例如丁酸鈉、曲古抑菌素A、丙戊酸等也被用作重組桿狀病毒攜帶p53基因的聯(lián)合治療藥物。另一種抑癌基因——正常上皮細(xì)胞特異性因子1也在重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的作用下顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖，瘤內(nèi)注射后有效率可達(dá)42.3%[13]。Apoptin蛋白是一種能夠誘導(dǎo)凋亡的蛋白，且特異性地存在于惡性增生的癌細(xì)胞中。將Apoptin基因連入桿狀病毒載體后導(dǎo)入機(jī)體，只有癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，正常細(xì)胞并不受影響，且瘤內(nèi)注射該重組載體能夠顯著縮小肝癌細(xì)胞的體積[14]。Rta蛋白是EB病毒由潛伏期轉(zhuǎn)向裂解期的關(guān)鍵性調(diào)控因子，其與桿狀病毒構(gòu)成的重組桿狀病毒能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖[15]。另外，將靶向的短發(fā)夾RNA利用重組桿狀病毒導(dǎo)入癌細(xì)胞是另一種具有應(yīng)用前景的基因治療方法[16]。

3 桿狀病毒作為基因治療載體的優(yōu)勢

作為基因治療過程中運(yùn)輸治療基因的工具，目前常用的轉(zhuǎn)移基因的方法分為非病毒載體系統(tǒng)和病毒載體系統(tǒng)[17]。非病毒載體系統(tǒng)具有毒性小、安全性高、外源基因長度不受限制的優(yōu)點(diǎn)，但由于人體生理屏障和載體本身的特性，其較低的感染效率和更短的目的基因持續(xù)表達(dá)時(shí)間限制了臨床應(yīng)用。

臨床基因治療使用的病毒載體主要來源于反轉(zhuǎn)錄病毒(RV)、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等，但均具有明顯的缺陷。相比而言，桿狀病毒作為真核生物表達(dá)載體，其在攜帶治療基因、表達(dá)外源蛋白方面的優(yōu)勢表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)桿狀病毒具有很高的宿主特異性，專一寄生于無脊椎動物，對于人體來說，安全性高于上述病毒載體；(2)桿狀病毒載體容量大，且多啟動子技術(shù)可使載體能夠同時(shí)表達(dá)多種蛋白[18]；(3)桿狀病毒基因組中的ph/p10基因具有強(qiáng)啟動子，可用于完成目的基因的高效轉(zhuǎn)錄[19]；(4)昆蟲細(xì)胞可對外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，保證了蛋白的生物活性[20]；(5)桿狀病毒不會在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制，也不在這類細(xì)胞中增殖和擴(kuò)散，故不會刺激哺乳動物產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[3]?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，桿狀病毒載體在基因治療方面具有良好的應(yīng)用前景。

4 重組桿狀病毒在基因靶向治療中面臨的問題

重組桿狀病毒攜帶的治療基因在哺乳動物細(xì)胞中能否高效表達(dá)，是其臨床應(yīng)用面臨的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)。桿狀病毒不能在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制，但在某些哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，在活性的啟動子控制下，外源目的基因能夠被高效轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定表達(dá)。這一特性為桿狀病毒應(yīng)用于哺乳動物創(chuàng)造了條件，HOFMANN等[21]在1995年利用了重組AcNPV為載體，在CMV啟動子作用下，使外源基因在肝細(xì)胞中得以表達(dá)。另外，重組桿狀病毒載體的表面修飾也是提高外源基因作用效應(yīng)的方法，將RGD肽與桿狀病毒的囊膜糖蛋白GP64融合，可以大大提高載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[22]。同樣，將水皰性口炎病毒膜蛋白G連入重組載體，也能在體內(nèi)外試驗(yàn)中提高重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[23]。MKEL等[24]將LyP-1、F3以及CGKRK腫瘤靶多肽分別載入桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，導(dǎo)入人乳腺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)這些經(jīng)過表面修飾載體的效率高于未修飾載體的2～5倍。

另一限制重組桿狀病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的因素為該病毒對體內(nèi)補(bǔ)體反應(yīng)的不耐受性。重組桿狀病毒作為一個(gè)病毒載體，能夠激活機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致病毒不能發(fā)揮作用，且無法裂解癌細(xì)胞，這大大降低了該病毒的作用效果。為了規(guī)避體內(nèi)補(bǔ)體反應(yīng)，將人衰變加速因子與GP64蛋白融合，可使重組桿狀病毒載體具有抗補(bǔ)體作用，并且不干擾病毒的復(fù)制[25]。

除了上文提到的提高載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、規(guī)避補(bǔ)體系統(tǒng)反應(yīng)等問題，重組桿狀病毒對相應(yīng)癌細(xì)胞的靶向性也是在投入臨床使用之前必須解決的問題。尋求更多具有組織特異性表達(dá)的啟動子和microRNA是推廣這一技術(shù)的根本所在，這需要科研工作者付出更多的努力。

5 重組桿狀病毒在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景

自人類于20世紀(jì)80年代利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人干擾素后，經(jīng)過三十多年的發(fā)展，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)與大腸桿菌、酵母等表達(dá)系統(tǒng)齊名，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因治療、疫苗制備、單克隆抗體生產(chǎn)以及生物防治等多個(gè)領(lǐng)域。2004年4月由我國自主研發(fā)的重組人p53腺病毒注射液獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市并正式應(yīng)用于臨床，這意味著利用基因治療惡性腫瘤成為可能。重組桿狀病毒為生物技術(shù)廣泛應(yīng)用的一種有力載體，盡管其在基因治療過程中存在各種各樣的問題，但是其具有的攜帶DNA容量大、可操作性好、可同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，使其充當(dāng)?shù)幕騻鬟f系統(tǒng)這一角色具有不可替代的作用，今后將有更多有效的治療基因會通過重組桿狀病毒實(shí)現(xiàn)其臨床應(yīng)用。