任永強(qiáng)，李慶華，黃新建，董 麗

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(簡稱皮膚鱗癌)來源于皮膚的鱗狀上皮組織，是我國常見的皮膚惡性腫瘤之一，好發(fā)于老年人，至今病因尚未明確，認(rèn)為可能與化學(xué)致癌劑、慢性炎癥、人乳頭瘤病毒感染等有關(guān)[1]。因此，了解皮膚鱗癌的發(fā)病機(jī)制，尋找其發(fā)生過程的關(guān)鍵分子，對(duì)于其診療具有重要意義。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(pituitary tumor transforming genes, PTTG)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)原癌基因，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。有研究表明，PTTG在多種腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，如食管鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[3]。有關(guān)皮膚鱗癌中PTTG的研究較少，文獻(xiàn)報(bào)道下調(diào)PTTG基因表達(dá)可明顯抑制皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移，下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，并在裸鼠移植瘤模型中得到證實(shí)[4-5]。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，參與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等過程，其激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[6]。PTTG是否可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路影響皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡還未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾(RNAi)抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431中PTTG的表達(dá)，旨在探討抑制PTTG表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞活力、凋亡的影響，并進(jìn)一步探討對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco公司；MTT、DMSO、ROS檢測試劑盒均購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；LY294002及PTTG、AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax抗體均購自美國CST公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)為生長至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.3 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1天，以每孔3×105個(gè)接種生長至對(duì)數(shù)期的A431細(xì)胞于6孔板，每孔2 mL，次日，待細(xì)胞達(dá)70%～80%生長融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染參照Lipofectamin 2000試劑盒說明。轉(zhuǎn)染4 h后，更換為含血清的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育48 h。收獲細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)分組：空白組(未轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞)(n=3)、NC組(轉(zhuǎn)染無干擾作用siRNA)(n=3)和si-PTTG組(轉(zhuǎn)染si-PTTG)(n=3)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞活力以每孔1.0×104個(gè)接種A431細(xì)胞于96孔板，每孔100 μL，于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，將si-PTTG轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24、48和72 h，每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，每孔中加DMSO 200 μL，震蕩10 min。酶標(biāo)儀上，選擇490 nm波長，調(diào)零后測定各孔的吸光度值(A)。以A值反映細(xì)胞活力。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率以每孔3×105個(gè)將si-PTTG平鋪在6孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)染48 h后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至離心管，用含1%FBS的PBS洗滌細(xì)胞，不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，離心，棄去培養(yǎng)液，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明，通過流式細(xì)胞儀檢測(1 h內(nèi))。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blotsiRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法定量蛋白。按照每孔50 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加PTTG、AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜，加HRP標(biāo)記的二抗稀釋液，室溫孵育1～2 h，加ECL發(fā)光液，在暗盒中使用X光膠片曝光，拍照。Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS含量siRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，參照ROS檢測試劑盒說明，將適量DCFH-DA加入所有孔中(上機(jī)前30 min)，培養(yǎng)箱中孵育30 min，胰酶消化細(xì)胞，離心，PBS洗滌細(xì)胞及重懸細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞儀測定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后PTTG蛋白表達(dá)PTTG的特異性siRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞48 h，采用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效果(圖1)，si-PTTG組PTTG表達(dá)明顯低于空白組(P<0.05)，而NC組與空白組PTTG表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 Western blot法檢測siRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后PTTG蛋白表達(dá)

2.2 沉默PTTG表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞活力的影響MTT法檢測轉(zhuǎn)染si-PTTG的A431細(xì)胞活力，si-PTTG轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞24、48和72 h，細(xì)胞活力均明顯降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 沉默PTTG表達(dá)后的A431細(xì)胞生長曲線

2.3 沉默PTTG表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞凋亡及ROS產(chǎn)生的影響si-PTTG轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞48 h，通過流式細(xì)胞術(shù)及ROS試劑盒分別檢測細(xì)胞凋亡率及ROS水平，與空白組比較，si-PTTG組細(xì)胞凋亡率及ROS含量均明顯升高(P<0.05，圖3)。

2.4 沉默PTTG表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響Western blot法檢測轉(zhuǎn)染si-PTTG 48 h的A431細(xì)胞AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白組比較，si-PTTG組p-AKT和Cyclin D1表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)明顯升高(P<0.05，圖4)。三組間AKT表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 抑制PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)A431細(xì)胞活力的影響與空白組比較，LY294002組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05，圖5)，而si-PTTG+LY294002組細(xì)胞活力明顯低于LY294002組(P<0.05)。

2.6 抑制PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響LY294002組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組，而si-PTTG+LY294002組細(xì)胞凋亡率高于LY294002組(P<0.05，圖6)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默PTTG表達(dá)后的A431細(xì)胞凋亡率及ROS含量

圖4 Western blot法檢測沉默PTTG表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路影響

圖5 抑制PI3K/AKT信號(hào)通路后A431細(xì)胞生長曲線

3 討論

人PTTG基因定位于染色體5q33，是新近發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，對(duì)血管生成、細(xì)胞周期調(diào)控、基因調(diào)控、染色體穩(wěn)定性維持、細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面均有調(diào)控作用[7]。正常組織中PTTG不表達(dá)或弱表達(dá)，而在腫瘤組織及細(xì)胞中呈明顯高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤生長密切相關(guān)[8]。有研究顯示，通過RNAi干擾PTTG基因表達(dá)可明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期[9]。上述研究提示PTTG在腫瘤中的重要作用。已有研究表明，通過RNAi抑制PTTG表達(dá)可降低皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討PTTG表達(dá)抑制對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，結(jié)果顯示，RNAi沉默PTTG表達(dá)可明顯抑制皮膚鱗癌A431細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示抑制PTTG表達(dá)可能是皮膚鱗癌基因治療的手段之一。

ROS是一類含氧的具有化學(xué)活性的分子，ROS適度升高對(duì)細(xì)胞增殖和分化具有促進(jìn)作用，而過高的ROS水平可引起脂質(zhì)、蛋白及DNA的氧化損傷。腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平被誘導(dǎo)后繼續(xù)升高，可引起細(xì)胞凋亡[10]。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ROS產(chǎn)生已成為腫瘤治療的手段之一。有研究表明，誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞ROS產(chǎn)生可明顯促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默PTTG表達(dá)可明顯誘導(dǎo)A431細(xì)胞ROS產(chǎn)生。提示誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生可能是沉默PTTG表達(dá)誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)與腫瘤密切相關(guān)的重要的信號(hào)途徑，可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活、侵襲遷移、新生血管形成及抑制細(xì)胞凋亡等一系列方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因而成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)[12]。有研究表明，慢病毒介導(dǎo)的PTTG基因表達(dá)沉默可通過調(diào)節(jié)PI3K信號(hào)通路抑制垂體腺瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[13]。Cyclin D1是一個(gè)細(xì)胞周期蛋白，可促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄合成，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，Cyclin D1過表達(dá)可促進(jìn)包括皮膚鱗癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞生長[14]。BCL-2家族成員與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Bax是BCL-2家族成員之一，發(fā)揮促凋亡作用，上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制PTTG基因表達(dá)可明顯下調(diào)p-AKT和Cyclin D1表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，提示沉默PTTG表達(dá)可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路降低皮膚鱗癌細(xì)胞生長。LY294002是PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑，可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LY294002可抑制A431細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可增加沉默PTTG表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞活力抑制和凋亡促進(jìn)作用。提示沉默PTTG表達(dá)可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路降低皮膚鱗癌細(xì)胞生長。

圖6 抑制PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響

綜上所述，沉默PTTG基因表達(dá)可抑制皮膚鱗癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與提高細(xì)胞ROS水平及抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。