郝美玲，程 玉，劉海旺，李春輝

胃癌發(fā)病率及病死率較高，2015年中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告我國(guó)每年胃癌新發(fā)患者67.9萬(wàn)例，死亡患者49.8萬(wàn)例[1]。研究顯示有些腫瘤細(xì)胞中BMP信號(hào)通路的抑制劑可通過(guò)抑制BMP信號(hào)通路，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。目前，胃癌中心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)通過(guò)抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)MMP的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本文著重探討ANP在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，分析ANP表達(dá)與BMP信號(hào)通路相互作用對(duì)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，為胃癌的發(fā)病機(jī)制及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2018年1月～2018年9月存檔的胃癌標(biāo)本60例和距腫瘤邊緣≥5 cm正常胃黏膜組織60例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未行放、化療和免疫治療，具有手術(shù)治療適應(yīng)癥，符合胃腺癌手術(shù)病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。按美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer Staging, AJCC)第7版進(jìn)行分期，男性49例，女性11例；年齡35～81歲，中位年齡58歲；根據(jù)WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤進(jìn)行組織學(xué)分型，其中高分化1例，中分化30例，低分化29例。胃癌細(xì)胞株MGC-803由承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所饋贈(zèng)。

1.2 免疫組化將收集的組織常規(guī)取材，石蠟包埋，切片。采用免疫組化EnVision法染色，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ANP定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性。應(yīng)用半定量積分法進(jìn)行染色細(xì)胞的判讀，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野。(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分[3-4]。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～3分為陰性，4～6分為陽(yáng)性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株MGC-803置于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)后的胃癌細(xì)胞MGC-803分為兩組：加入ANP組(ANP陽(yáng)性組)、未加入ANP組(ANP陰性組)。

1.4 Western blot法提取組織及處理后對(duì)MGC-803細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行標(biāo)記，存于-80 ℃冰箱中，備用。取等量蛋白置于加樣孔中進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗(1 ∶200)、洗膜、加入二抗及洗膜后，于暗室進(jìn)行顯影，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以膠片上條帶的方式呈現(xiàn)。

1.5 CCK8法將ANP陽(yáng)性組與ANP陰性組中的MGC-803細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，分別接種于96孔板中(每孔2 000個(gè))，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，設(shè)立空白對(duì)照組即不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，分別于4、24、48、72 h在上述培養(yǎng)孔中加入終濃度為10%的CCK8試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，最后利用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度值，并繪制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。細(xì)胞存活率(%)=(ANP陽(yáng)性組OD值-空白組OD值)/(ANP陰性組OD值-空白組OD值)×100%，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)將基膜基質(zhì)原液置于4 ℃冰箱過(guò)夜融化，將基膜基質(zhì)原液和預(yù)冷的無(wú)血清 RPMI 1640 培養(yǎng)液按1 ∶3的比例配制侵襲小室的上室凝膠液，每孔 50 μL 包被侵襲小室的上室，放置 37 ℃ 孵育箱孵育2 h使其成膠。將MGC-803細(xì)胞消化制備細(xì)胞懸液，Transwell小室上室每孔接種200 μL 不含血清細(xì)胞懸液，下室加入含 10%胎牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)液500 μL。將Transwell 板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用結(jié)晶紫染色。通過(guò)顯微鏡觀(guān)察被染色的細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ANP的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系免疫組化法檢測(cè)60例胃癌組織及對(duì)應(yīng)的正常胃組織中ANP蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，ANP蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性率(18.3%，11/60)低于正常胃組織(78.3%, 47/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.26,P<0.05，圖1)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP蛋白與患者年齡、性別、TNM分期、組織學(xué)分型、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05，表1)。

2.2 ANP對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖和侵襲的影響采用CCK8法檢測(cè)ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組中胃癌細(xì)胞MGC-803增殖速度的變化，結(jié)果顯示：與ANP陰性組相比，ANP陽(yáng)性組胃癌細(xì)胞的增殖速率下降(P<0.05，表2)。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組中胃癌細(xì)胞MGC-803侵襲能力，結(jié)果顯示：ANP作用于胃癌細(xì)胞MGC-803 24 h后，ANP陽(yáng)性組細(xì)胞在4、24 h穿過(guò)的小孔細(xì)胞數(shù)分別為(34.72±7.92)個(gè)、(114.67±19.27)個(gè)，ANP陰性組分別為(54.72±7.84)個(gè)、(221.91±17.59)個(gè)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1A. 正常胃黏膜組織中ANP呈強(qiáng)陽(yáng)性，定位于細(xì)胞質(zhì)，EnVision法；B. 胃腺癌組織中ANP呈陽(yáng)性，定位于細(xì)胞質(zhì)，EnVision法圖2Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組中胃癌細(xì)胞MGC-803的侵襲能力：A. 4 h后ANP陽(yáng)性組中胃癌細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)；B. 24 h后ANP陽(yáng)性組中胃癌細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)；C. 4 h后ANP陰性組中胃癌細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)；D. 24 h后ANP陰性組中胃癌細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)

表1 胃癌臨床病理特征與ANP表達(dá)的關(guān)系

表2 ANP陰性組和ANP陽(yáng)性組中胃癌細(xì)胞MGC-803在不同時(shí)間生長(zhǎng)速率的變化(%)

與ANP陰性組相比，*P<0.05

2.3 ANP對(duì)不同蛋白表達(dá)的影響采用Western blot法檢測(cè)ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組胃癌細(xì)胞中BMP通路相關(guān)蛋白BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示ANP陽(yáng)性組中BMP6/7、p-Smad1/5的相對(duì)表達(dá)量[(0.94±0.09)、(1.22±0.10)]比ANP陰性組[(0.24±0.02)、(0.55±0.07)]高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；Smad1/5的ANP陽(yáng)性組相對(duì)表達(dá)量(0.30±0.04)比ANP陰性組(0.52±0.04)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示ANP可以激活BMP信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)能力。

Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白在A(yíng)NP陽(yáng)性組的相對(duì)表達(dá)量[(0.85±0.10)、(0.25±0.03)、(0.37±0.04)]比ANP陰性組[(1.13±0.10)、(0.44±0.03)、(0.66±0.07)]均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；提示ANP陽(yáng)性組胃癌細(xì)胞的增殖能力比陰性組下降，且MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)減少，降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力下降，細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力也有所下降(圖3)。

圖3 Western blot法檢測(cè)ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組中胃癌細(xì)胞MGC-803與BMP信號(hào)通路活化的作用及對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響：A. ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組中BMP通路相關(guān)蛋白BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5的表達(dá)；B. ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)；C. ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組中BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量，*P<0.05

3 討論

胃癌的發(fā)病率及病死率在惡性腫瘤中一直居高不下，呈逐年上升趨勢(shì)。早期胃癌多無(wú)癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，患者預(yù)后差，生存質(zhì)量下降，然而關(guān)于胃癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]，因此探討胃癌的發(fā)病機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。

ANP具有擴(kuò)血管、利尿、拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌激素等多種作用，在心血管中報(bào)道較多[5]。目前ANP在腫瘤中的研究較少，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)ANP可抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[6]，且ANP抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及在胃癌組織中的表達(dá)罕見(jiàn)報(bào)道。Li等[7]通過(guò)電鏡觀(guān)察ANP合成細(xì)胞存在于大鼠的胃黏膜組織中，在人正常胃黏膜中也有ANP的表達(dá)，定位于胃黏膜細(xì)胞的胞質(zhì)中，本組免疫組化結(jié)果顯示ANP在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)量低于正常胃黏膜，提示ANP表達(dá)異常與胃癌的發(fā)生有重要聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)胃癌細(xì)胞MGC-803的ANP陽(yáng)性組與陰性組經(jīng)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相同時(shí)間內(nèi)ANP陽(yáng)性組胃癌細(xì)胞的侵襲率低于A(yíng)NP陰性組，且隨時(shí)間的推移越來(lái)越低；同時(shí)利用CCK8法檢測(cè)兩組胃癌細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn)，ANP陽(yáng)性組的胃癌細(xì)胞增殖率低于陰性組，隨時(shí)間的變化越來(lái)越低，表明ANP可以降低胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖和抑制癌細(xì)胞的侵襲。

為了明確ANP降低胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖和抑制癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制，本組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ANP陽(yáng)性組和ANP陰性組中BMP通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示ANP陽(yáng)性組比ANP陰性組BMP-6/7和p-Smad1/5的表達(dá)升高，Smad1/5、Ki-67、MMP-2和MMP-9的表達(dá)下降。眾所周知，Ki-67增殖指數(shù)下降，細(xì)胞的增殖活性降低。MMP-2和MMP-9能降解細(xì)胞外基質(zhì)、影響細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少細(xì)胞間黏附性，間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示加入ANP后可能刺激BMP信號(hào)通路活化，激活Smad1/5磷酸化，影響核內(nèi)Ki-67、MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的翻譯，提高Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞的增殖活性升高及細(xì)胞間的黏附作用減小；提示ANP可通過(guò)激活BMP信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。

另外，本組實(shí)驗(yàn)收集胃癌患者的臨床病理特征，并分析胃癌組織中ANP的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示：ANP在胃癌組織中的表達(dá)與患者性別、年齡、組織學(xué)分型、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無(wú)關(guān)，該結(jié)果與ANP細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定差異，可能與本組樣本數(shù)量較少有關(guān)，故需加大樣本量進(jìn)一步分析。

總之，胃癌中ANP可能活化BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并可通過(guò)上調(diào)Smad1/5的磷酸化，使細(xì)胞核中某些基因轉(zhuǎn)錄異常，影響調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，發(fā)生細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。