黃瑋　張琪　朱月琴　曹琰　劉產(chǎn)明

摘要 目的：探討振元復脈顆粒治療慢性心律失常模型大鼠的可能機制。方法：將60只SD大鼠隨機分為空白組（10只）及造模組（50只），造模組大鼠接受尾靜脈注射氯化鋇溶液制備心律失常模型，將46只成模大叔數(shù)字隨機分為模型組及干預組，每組23只。其中干預組大鼠利用振元復脈顆粒灌胃，模型組大鼠接受等體積生理鹽水灌胃，均干預4周。比較各組大鼠心電圖指標，外周血SOD、MDA、心臟組織Na+-K+-ATP、心臟組織PI3K、AKT、p-AKT濃度變化。結果：與模型組比較，振元復脈顆粒可明顯縮短模型鼠心律失常持續(xù)時間（P<0.05）;下降外周血MDA、Bax水平;上調(diào)SOD、PI3K、p-Akt、Bcl-2水平及Na+-K+-ATP酶活性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：振元復脈顆粒可明顯對抗心率失常，具有保護心肌組織的作用，其作用機制可能與抗氧自由基、抑制心肌細胞凋亡有關。

關鍵詞 心律失常;振元復脈顆粒;SOD;MDA;Na+-K+-ATP酶;PI3K-AKT通路;心肌凋亡

Abstract Objective：To explore the possible mechanism of Zhenyuan Fumai Granules in the treatment of chronic arrhythmia model rats.Methods：A total of 60 SD rats were randomly divided into blank group（n=10）and modeling group（n=50）.The modeling group was injected with barium chloride solution through tail vein to establish arrhythmia model.A total of 46 model rats were randomly divided into model group（n=23）and intervention group（n=23）.Among them， the rats in the intervention group were given intragastric administration of Zhenyuan Fumai Granules for 4 weeks， and the rats in the model group were given intragastric administration of the same volume of normal saline for 4 weeks.ECG indexes， SOD and MDA in peripheral blood， Na+-K+-ATP in heart tissue， as well as concentration changes of PI3K， AKT and p-AKT in heart tissue were compared in each group.Results：1）Compared with the model group， Zhenyuan Fumai Granules could significantly shorten the duration of arrhythmia（P<0.05）， decrease the levels of MDA and Bax in peripheral blood， and increase the levels of SOD， PI3K， p-Akt and Bcl-2 as well as Na+-K+-ATP activity.The differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Zhenyuan Fumai Granules can obviously antagonize arrhythmia and protect myocardial tissue， and its mechanism may be related to anti-oxygen free radicals and inhibition of cardiomyocyte apoptosis.

Keywords Arrhythmia; Zhenyuan Fumai Granules; SOD; MDA; Na+-K+-ATPase; PI3K-AKT pathway; Myocardial apoptosis

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.02.020

諸多心臟疾病均可以心律失常為臨床表現(xiàn)，是導致死亡的主要原因。目前抗心律失常西藥的有效率為30%～60%[1]，且常具有誘發(fā)新的心律失?；蛟行穆墒С２∏榧觿〉娘L險[2-3]。故探索新的抗心律失常方法迫在眉睫。中醫(yī)藥療法以其安全性高、療效顯著，被諸多臨床工作者所重視。臨床文獻顯示心腎陽虛、痰瘀痹阻是心律失常的主要病機，基于此有助陽散寒、活血化瘀通絡的作用振元復脈顆粒是有效治療心律失常的手段，臨床不乏相關報道，但其作用機制目前尚未知。本研究通過心電圖檢測、Elisa法、Western Blot法對心律失常模型鼠進行檢測，旨在探討振元復脈顆粒的可能作用機制，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 將60只雄性SPF級的SD大鼠納入研究，體質量220～260 g，平均體質量（221±9.47）g，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：2007000509960，許可證號：SC-SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于本院動物實驗中心，補充具體的飼養(yǎng)條件：12 h/12 h晝夜交替，溫度（25±2）℃，濕度（50±1）%。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會審批同意（倫理審批號：2738273292）。

1.1.2 試劑與儀器 超微量Na+-K+-ATP酶測試盒（上海百蕊生物科技有限公司，批號2932）、SOD試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號X632）、MDA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號2231）、SDS-PAGE電泳凝膠試劑盒（碧云天生物公司，批號P0012A）、PI3K單克隆一抗抗體（美國CST公司，貨號：17366S）、Akt單克隆一抗抗體（美國CST公司，貨號：4685S），p-Akt單克隆一抗抗體（美國CST公司，貨號：4060T）及β-actin抗體（美國CST公司，貨號：3700T），4%氯化鋇（Alfa Aesar公司，貨號：10361-37-2）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組：將60只SD大鼠隨機分為空白組（10只）及造模組（50只），造模組大鼠接受尾靜脈注射氯化鋇溶液制備心律失常模型，將46只成模大叔數(shù)字隨機分為模型組及干預組，每組23只。2）模型制備：對造模組大鼠進行稱重，按照3 mL/kg比例對大鼠進行腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠充分麻醉后將大鼠俯臥位固定于手術板上，充分固定后對大鼠四肢內(nèi)側皮下插入針狀電極，連接心電圖儀器，描記II導聯(lián)心電圖，基線調(diào)零，待描述出正常平穩(wěn)心電圖后將大鼠尾部充分消毒，按照4 mg/kg對大鼠尾靜脈快速推注0.4%氯化鋇溶液，5 s內(nèi)完成，并開始記錄心電圖，共記錄30 min。空白組大鼠進行相同麻醉、固定操作，尾靜脈注射等體積比例的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 干預方法 干預組大鼠接受振元復脈顆粒水溶液灌胃給藥，劑量按照按人/鼠kg體質量的等效劑量計算，1次/d，連續(xù)干預4周。模型組及空白與等體積生理鹽水灌胃。

1.2.3 檢測指標及方法

1.2.3.1 ELISA法檢測各組外周血SOD、MDA水平變化 干預結束后各組大鼠隨機選取3只，按照3 mL/kg比例對大鼠進行腹腔注射10%水合氯醛，大鼠充分麻醉后去腹主動脈血，將標本置于4 ℃環(huán)境下5 000 r/min離心15 min，取出上清液，標準品的稀釋與加樣，在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）;用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min，在進行配液、加酶（空白孔不加酶），再進行溫育、洗滌，最后將孔板至于酶標儀上進行檢測，讀取出各組樣本的OD值。

1.2.3.2 ELISA法檢測各組心臟組織Na+-K+-ATP酶水平變化 待1.2.3.1步驟大鼠取完腹主動脈血后于冰快速取出各組大鼠的心臟組織，稱取約0.1 g組織，加入RIPA裂解液和10 μL PMSF進行冰浴勻漿，置于4 ℃環(huán)境下5 000 r/min離心15 min，取上清，余下步驟同1.2.3.1。

1.2.3.3 Western blotting檢測各組PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax的水平變化 干預結束后從各組大鼠中隨機選取3只大鼠，麻醉處死后在冰浴上將大鼠心臟組織迅速取出，加入1 mL RIPA裂解液和10 μL PMSF進行冰浴勻漿，充分反應后將樣本置于4 ℃，5 000 r/min分離15 min，吸取上清液后加入4X蛋白上樣緩沖液，在金屬浴儀中進行蛋白變性7 min，將樣品加入至事先配制好的SDS-PAGE電泳凝膠內(nèi)，總蛋白量30 μg，電泳結束后將目標蛋白轉移至PVDF膜，轉膜后用脫脂奶粉封閉2 h，用0.01 mol/L PBS溶液沖洗干凈后分別加入PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax以及β-actin一抗抗體，4 ℃下孵育24 h，次日取出PVDF膜后用TBST清洗3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000）室溫下孵育1 h，加入ECL溶液，反應1 min后進行曝光掃描，用Image J軟件掃描條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用（±s）表達，組間統(tǒng)計均采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心電圖結果比較 50只造模組大鼠中46只成模，出現(xiàn)心律失常，造模成功率92%。見圖1。模型組比較，振元復脈顆粒可明顯縮短模型鼠心律失常持續(xù)時間（P<0.05）。見表1。

2.2 各組MDA、SOD以及Na+-K+-ATP酶水平的變化 造模組大鼠外周血MDA水平明顯高于空白組，SOD低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中干預組MDA水平低于模型組，SOD高于模型組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與空白組比較，造模組大鼠心臟組織Na+-K+-ATP酶值明顯降低（P<0.05），與模型組比較，干預組Na+-K+-ATP酶明顯升高（P<0.05）;具體見表2。

2.3 各組大鼠心臟組織PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax的水平變化 與空白組比較，造模組大鼠心臟組織PI3K、p-Akt、Bcl-2水平明顯降低（P<0.05），Bax水平增加，與模型組比較，干預組PI3K、p-Akt、Bcl-2值明顯升高，Bax水平明顯下調(diào)（P<0.05），各組AKT濃度相仿（P>0.05）。見圖2、圖3，表4。

3 討論

心腎陽虛是本病的主要病機，陽虛血脈無以溫煦，氣血運行不暢而出現(xiàn)瘀血、痰濁等病理產(chǎn)物[4-5]，因虛致實，虛實夾雜，互為因果，瘀血/痰濁痹阻心脈，故溫腎助陽、活血化瘀通絡是治療心律失常的主要原則[6-8]，因此國內(nèi)有學者提出“溫通剔絡”的觀點[9]。所謂的“溫通”即溫陽通脈，“剔絡”即搜剔脈絡，由此創(chuàng)立了振元復脈顆粒對心律失常進行治療，并獲得了理想的效果。方中附子有回陽救逆、補火助陽，散寒止痛功效，是“回陽救逆第一品”。附子可溫通上中下三焦，溫心陽以通心脈，助脾陽以散中寒，補腎陽以益火，溫通周身之陽。麻黃歸肺/膀胱二經(jīng)，可發(fā)汗解表、宣肺平喘，可通過破散之功以驅除寒邪、調(diào)節(jié)血脈[10-11]。麻黃和附子合用，一表一里，一收一散，二者共為君藥，即可助底部之火上揚，又可宣散頂部之寒，最終以增強發(fā)越陽氣之功。紅參有大補元氣、復脈固脫、益氣攝血的功效，促使機體扶正以驅邪外出。丹參具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛之功效，一方面可實現(xiàn)瘀除而新生，另一方面可助紅參益氣養(yǎng)心，復脈定悸。白芥子有溫肺豁痰利氣散結通絡止痛的作用，逐寒痰而通血脈[12]。白僵蠶具有息風止痙，祛風止痛，化痰散結之功效，與白芥子共為佐藥。熟地黃歸肝腎二經(jīng)，是滋陰補血之要藥，即可生化陽氣又可潤燥，此外，腎主水藏精，熟地黃可生津潤燥，有助腎陽生精化水，以實現(xiàn)“陰陽和合”[13]。整方共奏溫腎助陽、活血化瘀通絡、安神定悸之功。在研究中我們利用氯化鋇溶液制備心律失常大鼠模型，結果顯示使用振元復脈顆粒干預的大鼠心律失常持續(xù)時間明顯較模型組縮短，這提示振元復脈顆?？擅黠@改善心律失常癥狀。

自由基可導致機體組織細胞產(chǎn)生脂質過氧化，隨后產(chǎn)生一系列有害物質對組織/細胞產(chǎn)生不良反應，其中丙二醛（MDA）是被公認的可誘導心肌細胞損傷的脂質過氧化物，有研究[14-15]顯示隨著MDA濃度的升高，大鼠罹患致命性心律失常的風險增加，給予抗氧自由基對心肌細胞可產(chǎn)生高度保護效應。SOD是機體質量要的氧自由基清除酶，可促使機體的氧自由基產(chǎn)生氧化效應，SOD的水平代表機體對氧自由基清除能力的高低，MDA的表達變化間接體現(xiàn)氧自由基對組織/細胞的損傷程度，故檢測MDA與SOD水平的變化可提現(xiàn)干預手段的抗心律失常能力。研究中我們發(fā)現(xiàn)造模組大鼠外周血MDA水平明顯高于空白組，SOD低于空白組，經(jīng)過振元復脈顆粒干預后大鼠MDA水平降低，SOD上調(diào)，提意味著振元復脈顆粒增強了機體的抗氧自由基能力，與此同時我們通過檢測發(fā)現(xiàn)振元復脈顆?？擅黠@上調(diào)模型鼠Na+-K+-ATP酶，而Na+-K+-ATP酶是心肌能量釋放的直觀體現(xiàn)，這說明振元復脈顆粒上調(diào)了心肌的能量供應，改善心肌供血。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)振元復脈顆?？山閷募〗M織PI3K-Akt信號通路的標志性蛋白產(chǎn)生變化。PI3K-Akt信號通路是經(jīng)典的與細胞凋亡相關的分子生物學信號通路，PI3K是脂質激酶，其發(fā)生磷酸化激活后誘導下游Akt的構象產(chǎn)生變化，隨即發(fā)生一系列聯(lián)級反應，對下游的因子表達產(chǎn)生影響，其中與凋亡密切相關的當屬Bcal-2及Bax[16-17]。本研究我們發(fā)現(xiàn)造模組大鼠心臟組織PI3K、p-Akt、Bcl-2水平明顯降低，Bax水平增加，經(jīng)過振元復脈顆粒干預后I3K、p-Akt、Bcl-2值明顯升高，Bax水平明顯下調(diào)。這意味著振元復脈顆?？剐穆墒СＥcPI3K-Akt信號通路密切相關。

總之，振元復脈顆粒可明顯對抗心率失常，具有保護心肌組織的作用，其作用機制可能與抗氧自由基、抑制心肌細胞凋亡有關。

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（2019-06-15收稿 責任編輯：王明）