楊家樹(shù)，戚麗華，吳 方，袁永陽(yáng) 綜述，劉 杰，△ 審校

(1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510280；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100700；3.陸軍第九五七醫(yī)院檢驗(yàn)科，西藏阿里 859000)

呼吸道感染是一種呼吸系統(tǒng)的常見(jiàn)病，在季節(jié)變換期間更容易發(fā)生。流感病毒也極易感染人群，從而引起流感的暴發(fā)。目前病原微生物從鑒定到藥物敏感性檢測(cè)，其過(guò)程一般是2～3 d，結(jié)核桿菌的培養(yǎng)檢測(cè)通常要14～35 d，這很難滿足臨床對(duì)致病菌快速診斷的要求[1]。由于核酸分子檢測(cè)的高特異度和高靈敏度的特點(diǎn)，近年來(lái)隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的新型擴(kuò)增技術(shù)也發(fā)展起來(lái)。微流控技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)的結(jié)合，使得微流控LAMP技術(shù)不僅具有PCR技術(shù)的高靈敏度和高特異度，同時(shí)操作過(guò)程變得十分簡(jiǎn)單，特別適用于基層醫(yī)院和偏遠(yuǎn)地區(qū)。但核酸提取速度是制約微流控LAMP技術(shù)發(fā)展的重要因素，快速核酸提取的發(fā)展會(huì)進(jìn)一步提高微流控LAMP技術(shù)的發(fā)展前景。

1 微流控芯片和LAMP技術(shù)原理

1.1微流控技術(shù) 20世紀(jì)末微流控技術(shù)研究開(kāi)始發(fā)展，它是由微結(jié)構(gòu)和微通道組成，運(yùn)用了微電機(jī)系統(tǒng)、微流體技術(shù)、生物、化學(xué)等多方面技術(shù)。它可以在微納米級(jí)別的空間內(nèi)精確操控微尺度流體。微流控芯片又叫“微流控芯片實(shí)驗(yàn)室”，它可以巧妙地把整個(gè)分析過(guò)程的基本操作集成到一片微米尺寸的芯片上，自動(dòng)完成分析的全過(guò)程，具有規(guī)模集成、儀器微小化，節(jié)約試劑等眾多優(yōu)點(diǎn)，特別適用于即時(shí)診斷(POCT)和基層工作單位[2]。

1.2LAMP技術(shù) 自日本學(xué)者NOTOMI等[3]首次發(fā)布了LAMP技術(shù)以來(lái)，該技術(shù)發(fā)展迅速，其原理是通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因的6個(gè)特異區(qū)域設(shè)定4種引物，在恒溫條件下依賴一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，生成自我循環(huán)擴(kuò)增的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，使得目標(biāo)基因在短時(shí)間內(nèi)大量、高效地?cái)U(kuò)增。該技術(shù)具有較高的靈敏度和特異度，且速度快，只需要1 h左右即可檢測(cè)出病原菌，比傳統(tǒng)PCR技術(shù)節(jié)約時(shí)間，可以滿足臨床上快速檢查病原菌感染的要求；同時(shí)它所需要的設(shè)備比較簡(jiǎn)單，只需要一個(gè)恒溫箱，這大大減低了對(duì)大型實(shí)驗(yàn)室儀器的依賴，更易于在基層醫(yī)院開(kāi)展分子檢測(cè)。

1.3微流控芯片和LAMP技術(shù)的結(jié)合檢測(cè) 微流控芯片可以減少對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地和大型實(shí)驗(yàn)儀器的依賴性。LAMP技術(shù)則可以從分子方面更加準(zhǔn)確地診斷呼吸道感染的病原體。微流控和LAMP技術(shù)的結(jié)合，增加了儀器的便攜性，可以節(jié)約時(shí)間和試劑，同時(shí)對(duì)病原體的快速檢測(cè)有助于臨床診斷和指導(dǎo)臨床醫(yī)生針對(duì)性用藥，也避免了LAMP技術(shù)氣溶膠的污染[1,4]。在金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的檢測(cè)中，有研究證明微流控LAMP技術(shù)均有較高的靈敏度[5-6]。在兒童感染性呼吸道病原體方面，與應(yīng)用較多的傳統(tǒng)痰培養(yǎng)和血清學(xué)方法相比，微流控LAMP芯片法具有較高的檢出率[7]。

2 微流控LAMP技術(shù)在呼吸道感染疾病病原診斷的臨床應(yīng)用

呼吸道感染在臨床呼吸內(nèi)科中的發(fā)病率總是居高不下，呼吸道感染疾病按致病菌分為3類：細(xì)菌性感染、真菌性感染和病毒性感染。微流控LAMP技術(shù)作為一種快速核酸擴(kuò)增技術(shù)，特別適用于臨床病原菌的快速診斷[8]。

2.1微流控LAMP技術(shù)在細(xì)菌感染中的應(yīng)用 LAMP技術(shù)較早地應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的診斷，傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌的鑒定通常依賴于羅氏培養(yǎng)基，但是其培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，不利于臨床的早期診斷。SEKI等[9]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的共有基因hspX診斷其感染。大部分微流控LAMP技術(shù)只能證明病原體的存在，不能區(qū)分菌體是否存活及反映病原體感染性強(qiáng)弱[10]，因?yàn)榧词辜?xì)菌死亡，其DNA依然存在于人體內(nèi)，因此對(duì)臨床用藥劑量指導(dǎo)和判斷是否為急性感染有一定的限制。WU等[10]認(rèn)為可以通過(guò)RT-LAMP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的16S rRNA基因，區(qū)分出存活狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌。支原體肺炎是社區(qū)感染性肺炎的常見(jiàn)病原菌，研究表明檢測(cè)支原體時(shí)，LAMP技術(shù)的靈敏度和特異度分別為100.0%、94.3%[11]。有學(xué)者證實(shí)了LAMP技術(shù)在金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用[12-15]。

2.2微流控LAMP技術(shù)在呼吸道病毒感染中的應(yīng)用 LAMP技術(shù)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄形成的RT-LAMP技術(shù)可以用于呼吸道病毒的快速檢測(cè)。高杰等[16]利用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)了甲型H1N1、季節(jié)性H1N1和季節(jié)性H3N2亞型流感病毒及乙型流感病毒，結(jié)果顯示RT-LAMP技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中與熒光定量PCR技術(shù)具有相當(dāng)?shù)撵`敏度和特異度。MU等[17]利用人類呼吸道合胞病毒(HRSV)A組和B組特異的引物，分別擴(kuò)增HRSV的N和L基因，設(shè)計(jì)出逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)測(cè)定法，1 h內(nèi)可以同時(shí)檢測(cè)A和B兩組HRSV，較為快速方便。

2.3微流控LAMP技術(shù)在真菌感染中的應(yīng)用 侵襲性真菌感染大多是繼發(fā)性，臨床對(duì)其缺乏可靠性的病原學(xué)診斷[18]。LAMP技術(shù)作為一種分子診斷技術(shù)，在侵襲性真菌的快速診斷方面有著廣闊的應(yīng)用前景。肖晶晶等[19]針對(duì)白色念珠菌的RPS0基因，利用LAMP技術(shù)建立了檢測(cè)白色念珠菌的診斷方法，其檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為87.62%和88.33%，均高于PCR法。

3 微流控LAMP技術(shù)的技術(shù)缺陷及快速核酸提取改進(jìn)技術(shù)

微流控和LAMP技術(shù)的結(jié)合大大簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。但微流控和LAMP本身的技術(shù)缺陷制約了該項(xiàng)技術(shù)發(fā)展，同時(shí)不能有效簡(jiǎn)化核酸提取技術(shù)也限制了其應(yīng)用[20]。

3.1微流控LAMP技術(shù)的技術(shù)缺陷 LAMP技術(shù)自發(fā)明以來(lái)因其具有較高的靈敏度和特異度、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)而備受歡迎，但因其引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，擴(kuò)增需要多對(duì)引物容易引起非特異性擴(kuò)增，使得假陽(yáng)性率較高[20-22]。 在檢測(cè)致病菌DNA或者RNA時(shí)，大部分微流控LAMP技術(shù)檢測(cè)結(jié)果多為定性而不能定量，所以目前不能有效反映病原體感染性強(qiáng)弱[10]。微流控LAMP技術(shù)多以微流控芯片為基礎(chǔ)進(jìn)行巧妙結(jié)合，一定程度上增加了其實(shí)用性。目前微流控技術(shù)因其精確的微型流體控制技術(shù)而被廣泛應(yīng)用，但在制備過(guò)程中由于技術(shù)受限、芯片對(duì)生化試劑有吸附作用等因素在一定程度上限制了其推廣范圍[4,23]，而且在集成樣本核酸提取方面，由于難以精確控制氣壓使得樣本的核酸提取仍然是一個(gè)難以解決的關(guān)鍵問(wèn)題。不過(guò)微流控技術(shù)依然是最有希望將核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)集成為一體的技術(shù)[1,4,22]。

3.2微流控LAMP的快速核酸提取技術(shù) LAMP作為新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，依賴其檢測(cè)特點(diǎn)在呼吸道致病菌快速檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。在下呼吸道感染中檢出率和靈敏度均高于普通痰培養(yǎng)[24]。目前LAMP技術(shù)主要困難在于病原體核酸的快速提取。在進(jìn)行病原體檢測(cè)時(shí)，不能簡(jiǎn)化核酸提取，也限制了LAMP技術(shù)在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用[4]。常用的核酸提取方法包括：煮沸法、細(xì)胞裂解法、柱式過(guò)濾法和磁珠法。進(jìn)行提取DNA時(shí)，煮沸法和細(xì)胞裂解法方便、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單，提取過(guò)程中沒(méi)有DNA的損失；柱式過(guò)濾法和磁珠法可以有效清除干擾PCR擴(kuò)增的物質(zhì)，同時(shí)提取核酸純度高，但是過(guò)濾法在DNA損失方面比磁珠法更嚴(yán)重，同時(shí)在不同濃度、不同菌種的條件下，細(xì)胞裂解法的Ct值更小[25]。近些年有學(xué)者對(duì)這幾種核酸提取技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)化，一定程度上提高了微流控LAMP技術(shù)的實(shí)用性。

趙升等[26]通過(guò)一種快速核酸提取試劑檢測(cè)流感病毒時(shí)得到較高的提取效率，與離心柱法和磁珠法相比PCR結(jié)果相似。該提取試劑所有成分均在一管中，通過(guò)加熱裂解液破壞病毒外殼，釋放核酸，核酸穩(wěn)定劑防止核酸降解，裂解成分降解后，核酸分布于提取液上層，整個(gè)過(guò)程只需加熱和震蕩2個(gè)步驟，時(shí)間為4 min。KAWANO等[27]采用超快速提取(PURE)試劑盒，它的作用方式是使用一種吸附粉末，移除樣品中的DNA抑制劑，達(dá)到保護(hù)樣品DNA的目的，不需要復(fù)雜的設(shè)備即可在臨床樣品中分離DNA。孫魁[28]利用堿裂解法與紙基核酸提取技術(shù)，建立了堿裂解法結(jié)合紙基核酸純化的樣本處理體系(ALP FINA)，原理是利用強(qiáng)堿使核蛋白、核酸酶變性，使得DNA釋放，利用過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾得到核酸提取液，15 min左右即可得到提取液，整個(gè)過(guò)程不依賴電力、加熱和離心，可以方便地達(dá)到核酸提取，可用于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

4 小結(jié)與展望

LAMP技術(shù)因其恒溫?cái)U(kuò)增，操作簡(jiǎn)單，高靈敏度和高特異度的優(yōu)點(diǎn)而被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用。微流控的應(yīng)用減少了常規(guī)檢測(cè)對(duì)大型儀器和場(chǎng)地的依賴性。微流控LAMP技術(shù)鑒定致病菌因具有快速、高靈敏度和特異度的特點(diǎn)在臨床呼吸道感染中擁有較大的應(yīng)用前景。微流控LAMP技術(shù)的結(jié)合不僅簡(jiǎn)化了操作步驟，使得核酸分子檢測(cè)技術(shù)易于操作，同時(shí)也解決了LAMP技術(shù)的一些弊端。但是快速提取核酸仍然是目前限制微流控LAMP技術(shù)發(fā)展的因素，其次微流控和LAMP法的本身技術(shù)缺陷以及結(jié)果不能定量也限制了其臨床應(yīng)用。隨著科學(xué)研究的不斷深入，微流控LAMP技術(shù)不斷地改善和發(fā)展，它在病原體檢測(cè)方面將會(huì)發(fā)揮更大的作用。