王舒淇 綜述，王東生,2△ 審校

(1.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系,四川南充 637000；2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院/四川省腫瘤醫(yī)院研究所檢驗(yàn)科，四川成都 610041)

乳腺癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的2018年全國癌癥報告顯示，乳腺癌位居全國女性癌癥發(fā)病首位。盡管靶向治療及個體綜合治療發(fā)展迅速，乳腺癌仍然是當(dāng)今女性癌癥死亡的主要原因[1]。通過分析乳腺癌基因表達(dá)，將乳腺癌分為管腔上皮A型(LuminalA型、ER+或PR+、HER-2-)、管腔上皮B型(LuminalB型、ER+或PR+、HER-2+)、HER-2過表達(dá)型(ER-或PR-、HER-2+)、基底樣型(Basal-like型、ER-或PR-、HER-2-)和正常乳腺樣型[1-2]。其中基底樣型也稱三陰性乳腺癌(TNBC)，該類患者由于缺乏激素受體及人表皮生長因子受體，對激素治療及靶向治療均反應(yīng)甚微，因此其5年生存率較其他類型乳腺癌患者低。此外TNBC更易發(fā)生于年輕女性患者，且具有高度轉(zhuǎn)移性，可在3年內(nèi)復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移常見于腦、肝、肺等[3]。為了能在早期發(fā)現(xiàn)TNBC的轉(zhuǎn)移，改善預(yù)后,進(jìn)而提高其患者生存率，研究者需要對轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路及生物標(biāo)志物有更多的了解及認(rèn)識。microRNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼RNA，已被眾多研究證實(shí)可參與細(xì)胞分化、增殖、代謝及凋亡等生物學(xué)過程。同樣，在癌癥發(fā)生、發(fā)展的過程中，miRNA的表達(dá)情況與疾病的發(fā)展也有著千絲萬縷的聯(lián)系，其中包括腫瘤轉(zhuǎn)移。

1 miRNA的生物合成

miRNA是長度約為22～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA[4]，通過與其靶mRNA分子的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。miRNA合成首先發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，在RNA聚合酶Ⅱ的參與下，miRNA的編碼基因轉(zhuǎn)錄為長鏈初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)，之后由Drosha/RNaseⅢ識別，剪切為發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)[5]；隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)內(nèi)，被特異性的內(nèi)切酶RNase Ⅲ Dicer裂解，最終形成成熟的miRNA[6]。miRNA與其靶標(biāo)基因的mRNA互補(bǔ)程度決定了miRNA的作用結(jié)果，完全互補(bǔ)配對時miRNA會導(dǎo)致mRNA發(fā)生降解，而不完全互補(bǔ)配對時只能抑制靶基因mRNA的翻譯，不影響靶基因mRNA的穩(wěn)定[7]。自發(fā)現(xiàn)miRNA后的20多年間，癌癥成為了該領(lǐng)域研究重點(diǎn)，許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了腫瘤生長、侵襲、血管生成或是免疫逃避等過程[8]。當(dāng)然在TNBC的研究中，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)與疾病進(jìn)展的關(guān)鍵過程緊密相連，如上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、癌細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣特性、遷移、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等等。目前，針對TNBC患者的有效治療手段還相當(dāng)有限，但隨著miRNA研究的深入，相信其能為提示腫瘤或治療靶點(diǎn)做出貢獻(xiàn)。

2 miRNA與TNBC的關(guān)系

根據(jù)miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中產(chǎn)生的不同作用，將miRNA分為腫瘤促進(jìn)miRNA(onco-miRNA)和腫瘤抑制miRNA(ts-miRNA),通常onco-miRNA在腫瘤中上調(diào)，主要通過降解腫瘤抑制基因促進(jìn)癌細(xì)胞生長；ts-miRNA則在腫瘤中下調(diào)，主要以癌基因?yàn)榻到饽繕?biāo)，因此具有抗腫瘤功能[3,9]。與正常組織相比，幾乎在腫瘤發(fā)生過程的所有階段(細(xì)胞周期、凋亡、侵襲、血管生成)都存在miRNA表達(dá)失調(diào)的情況。

在多項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究中，研究者已經(jīng)證實(shí)數(shù)個miRNA參與發(fā)揮作用。PEREZ-ANORVE等[10]研究表明miR-122上調(diào)可促進(jìn)獲得性耐輻射乳腺癌的細(xì)胞存活，并提示miR-122具有作為腫瘤抑制因子和依賴于細(xì)胞表型的onco-miRNA的雙重功能，可在不同程度上控制對放療的反應(yīng)。BASOVA等[11]應(yīng)用縱向多變量數(shù)據(jù)分析隨機(jī)模型證實(shí)miR-155和miR-24可作為onco-miRNA，對早期乳腺癌復(fù)發(fā)有高度預(yù)測作用。SON等[12]報道m(xù)iR-374a-5p在TNBC患者中特異性上調(diào)，可作為onco-miRNA靶向TNBC的ARRB1，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。另外miR-4417被發(fā)現(xiàn)是TNBC的腫瘤抑制因子和預(yù)后生物標(biāo)志物，其表達(dá)在TNBC細(xì)胞從非惡性向惡性發(fā)展的過程中被抑制[13]。通過研究miR-4458與TNBC中SOCS1的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-4458直接與SOCS1結(jié)合，負(fù)調(diào)控SOCS1 mRNA和蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。

由此可見，miRNA與TNBC存在著一定的關(guān)聯(lián)性，其表達(dá)量的變化可能成為TNBC診斷、治療或預(yù)后判斷的依據(jù)。隨著越來越多新技術(shù)，如基因圖譜和測序、蛋白質(zhì)組學(xué)和miRNA分析等被用于探索包括TNBC在內(nèi)的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，新的治療方法很有可能在不久的未來被發(fā)現(xiàn)。

2.1miRNA與TNBC的轉(zhuǎn)移 腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤，通過淋巴、血液等轉(zhuǎn)移方式到達(dá)繼發(fā)組織或器官形成腫瘤的過程，是一個多步驟、多階段、連續(xù)復(fù)雜的生物學(xué)過程[15]，涉及多因素、多水平調(diào)節(jié)，其中包括腫瘤轉(zhuǎn)移基因、轉(zhuǎn)移抑制基因、細(xì)胞黏附因子、蛋白降解酶及機(jī)體免疫狀態(tài)等[16]。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移往往是腫瘤治療失敗,從而導(dǎo)致患者死亡的主要原因。隨著對miRNA研究的深入，越來越多的研究表明miRNA可通過EMT、腫瘤干細(xì)胞(CSCs)、腫瘤血管再生、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)等途徑調(diào)控惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。

有研究者采用Solexa深度測序法檢測TNBC細(xì)胞及非TNBC干細(xì)胞的miRNA表達(dá)水平，通過建立裸鼠動物實(shí)驗(yàn)、異種移植模型、熒光素酶報告基因分析等，證實(shí)miR-4319可以通過E2F2抑制TNBC腫瘤干細(xì)胞中腫瘤球的自我更新和形成，同時可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[17]。在腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用的研究中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞通過miRNA或外泌體參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明乳腺癌細(xì)胞可在凋亡過程中釋放高表達(dá)的miR-375，腫瘤源性miR-375可被CD36攝取，進(jìn)而促進(jìn)TAMs中miR-375的積累。在巨噬細(xì)胞中，miR-375可直接靶向TNS3和PXN，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞向腫瘤的遷移和浸潤；而在腫瘤細(xì)胞中，miR-375通過調(diào)節(jié)CCL2的表達(dá)來增加巨噬細(xì)胞的募集[18]。此外，miR-126-3p、miR-148a/152、miR-206均被發(fā)現(xiàn)參與TNBC血管形成過程[19-21]。

2.2miRNA參與TNBC的EMT過程 TNBC是乳腺上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤，而EMT可使上皮細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞獲得較強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移能力,從而導(dǎo)致腫瘤的浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移。在EMT誘導(dǎo)過程中，多種信號通路(如Wnt/β-catenin通路、TGF-β信號通路、Notch、PI3K等)，可通過影響SNAIL1、SNAIL2、TWIST、ZEB1、ZEB2等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，最終引起間充質(zhì)標(biāo)志物(如Vimentin、N-cadhefin等)表達(dá)上調(diào)，上皮標(biāo)志物(如E-cadherin、zonula occluden-1等)表達(dá)下調(diào)[22-23]。許多研究表明miRNA可通過參與調(diào)節(jié)信號通路或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在EMT過程中發(fā)揮作用。

miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)是被許多研究所證實(shí)的，在TNBC EMT過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用的因子[24]。研究表明miR-200是癌細(xì)胞上皮表型的一個標(biāo)志物,miR-200可直接靶向和下調(diào)E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1和ZEB2[25]，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞上皮表型的恢復(fù),而抑制miR-200可降低E-cadherin的表達(dá)并增加波形蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT[26-27]。有研究表明miR-200a可以抑制TNBC的遷移[28]；miR-200b可以抑制TNBC的EMT過程及遷移[29]；miR-200c可通過下調(diào)β-catenin和Vimentin，進(jìn)而調(diào)節(jié)Wnt信號通路相關(guān)基因，最終抑制TNBC的EMT過程[30]。然而，miR-200家族在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用卻存在爭議。有研究者發(fā)現(xiàn)miR-200在小鼠乳腺癌細(xì)胞系中的過表達(dá)表現(xiàn)出促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[31]。所以，盡管越來越多的證據(jù)表明，miR-200家族調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá)并參與EMT過程，但這并不一定能直接表明其能預(yù)測其侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能。顯然，這其中的機(jī)制需要更深入、更系統(tǒng)的研究，才能確定該家族在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。

miR-124在肝癌細(xì)胞中通過靶向ROCK2和EZH2體外抑制EMT發(fā)生和張力纖維形成，體內(nèi)抑制腫瘤肝臟和肺轉(zhuǎn)移[32]。而在TNBC細(xì)胞中miR-124通過靶向ZEB2降低其侵襲、轉(zhuǎn)移率，并抑制EMT過程[33]。表明同一miRNA在不同腫瘤中可發(fā)揮同樣的抑制EMT過程的作用。

研究通過比較miR-125b在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-125b在乳腺癌中的表達(dá)下調(diào)，提示miR-125b是乳腺癌的ts-miRNA，并發(fā)現(xiàn)其可能是通過靶向erbB2/erbB3通路或ETS1基因發(fā)揮作用[34-35]。然而又有研究者發(fā)現(xiàn)miR-125b在TNBC細(xì)胞MDA-MB-468中的表達(dá)明顯上調(diào)，抑制miR-125b在MDA-MB-468細(xì)胞中的表達(dá)后，細(xì)胞增殖、侵襲性和遷移能力均有降低，因此，miR-125b又可作為TNBC的onco-miRNA[36]。由此可見，同一miRNA在同一腫瘤的不同亞型中可能發(fā)揮著截然相反的作用。

近來miR-30a被發(fā)現(xiàn)在TNBC中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)的降低與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-30a的過表達(dá)增加了上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，降低了間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和vimentin的表達(dá)；而熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-30a特異性靶向ROR1，從而抑制TNBC細(xì)胞在體內(nèi)外的侵襲和轉(zhuǎn)移[37]。而另一項(xiàng)研究卻觀察到乳腺癌細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)降低與p53失活有關(guān)，進(jìn)而證明p53/miR-30a/ZEB2軸控制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)端擴(kuò)散，并影響miR-200c的表達(dá)[38]。這表明同一miRNA在同一腫瘤發(fā)展過程中可通過不同作用靶點(diǎn)調(diào)節(jié)EMT過程。

隨著miRNA研究熱度逐漸升高，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)在TNBC細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮作用。例如，最新的一些研究表明miR-212-5p可通過下調(diào)Prrx2抑制TNBC獲得EMT表型，從而抑制腫瘤進(jìn)展過程中的細(xì)胞遷移和侵襲[39]；miR-3178通過靶向降低Notch1的表達(dá)，參與EMT，抑制TNBC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[40]；miR-508-3p通過調(diào)控ZEB1表達(dá)，顯著抑制TNBC細(xì)胞EMT過程[41]。這些發(fā)現(xiàn)均證實(shí)miRNA可作為重要的調(diào)控因子，介導(dǎo)EMT的發(fā)生，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

3 循環(huán)miRNA可預(yù)測TNBC轉(zhuǎn)移

實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)miRNA參與TNBC轉(zhuǎn)移過程，在一定程度上能為TNBC早期轉(zhuǎn)移提供依據(jù)，但患者于治療過程中，反復(fù)行病理活檢監(jiān)測評估病情并不可行，此時一種可反復(fù)操作、微創(chuàng)且易于被患者接受的方法被研究者提出，即檢測血清中的miRNA[42]。KLEIVI等[43]證實(shí)，血清中miR-18b、miR-103、miR-107和miR-652高水平與TNBC患者原發(fā)腫瘤切除后36個月內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)。又有研究通過與健康對照組比較，發(fā)現(xiàn)TNBC患者血清miR-940表達(dá)顯著下調(diào)， miR-940低表達(dá)的TNBC患者總體生存率較miR-940高表達(dá)的TNBC患者低，且該miRNA水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)[44]。同時，有研究者采用實(shí)時PCR技術(shù)檢測血清中乳腺癌相關(guān)miRNA水平，發(fā)現(xiàn)miR-122、miR-21、miR-155在乳腺癌患者中表達(dá)明顯增加，miR-126明顯降低，且miR-122可在一定程度上提示轉(zhuǎn)移；相較于使用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清CA15-3和CEA有更高的靈敏度，且與臨床分期及組織學(xué)分級有更顯著的相關(guān)性[45-46]。由此可見，循環(huán)中存在著提示TNBC轉(zhuǎn)移的miRNA,但其在臨床應(yīng)用中的價值還需要接受更大規(guī)模臨床病例的驗(yàn)證。

4 小 結(jié)

TNBC作為乳腺癌預(yù)后較差的一個類型，其缺乏特異性的靶向治療藥物且轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高，導(dǎo)致患者病死率居高不下，因此備受關(guān)注。經(jīng)過眾多學(xué)者的不懈努力，發(fā)現(xiàn)miRNA不僅可作為TNBC分子特征，利于研究者對TNBC進(jìn)行分型；另一方面miRNA更是一種易于檢測的分子標(biāo)志物，可用于TNBC的病情監(jiān)測或治療指導(dǎo)。通過綜述miRNA在TNBC EMT調(diào)控轉(zhuǎn)移過程可看出，EMT受到不同轉(zhuǎn)錄因子及信號通路的調(diào)控，而miRNA可通過多種途徑參與其中，并且主要表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用。

目前，許多miRNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮致癌或抑癌作用，但實(shí)際上其并沒有發(fā)揮真正的診斷或臨床治療價值，并且在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用的miRNA尚未被完全發(fā)現(xiàn)，但是理解并運(yùn)用這些潛在的調(diào)控位點(diǎn)，尋找其上游或下游的作用基因，探討其聯(lián)合作用的臨床價值，可以增強(qiáng)對腫瘤轉(zhuǎn)移的認(rèn)識,有利于找出早期提示腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物或控制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效途徑。

作為檢驗(yàn)工作者，無論是組織標(biāo)志物(如尿激酶纖溶酶原激活劑、纖溶酶原激活劑抑制劑、組織蛋白酶D)、遺傳標(biāo)志物(如BRCA1、BRCA2、DNA倍性)、血清標(biāo)志物(如CA-549、MCA、MUC-1)[47]，亦或是循環(huán)miRNA,研究者期望能夠通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)利于早期診斷乳腺癌或提示乳腺癌轉(zhuǎn)移的高特異度、高靈敏度標(biāo)志物。例如，LEE等[48]利用等離子體頭部植絨金納米柱的表面，增強(qiáng)拉曼散射傳感器，定量、特異地檢測乳腺癌外泌體miRNA，得出一種高選擇性、高靈敏度的檢測外泌體miRNA的方法，對早期腫瘤診斷有重要意義，從而在腫瘤發(fā)生早期或腫瘤轉(zhuǎn)移早期提示臨床，達(dá)到改善患者預(yù)后的期望。