謝平林

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 閔行 200240)

2017年，我國(guó)畜牧生產(chǎn)總產(chǎn)值超過(guò)3.2萬(wàn)億元，其中豬肉產(chǎn)量居世界首位，占比達(dá)46.19%，可是未來(lái)市場(chǎng)發(fā)展并不樂(lè)觀。目前，畜禽規(guī)?；a(chǎn)對(duì)病原菌的防治常常局限于使用消毒劑和抗生素，因其濫用而導(dǎo)致藥物殘留與耐藥菌大量出現(xiàn)的問(wèn)題十分嚴(yán)重[1]。過(guò)去已經(jīng)得到良好控制的疾病再次對(duì)畜禽健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，養(yǎng)殖業(yè)也遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

目前利用有益微生物來(lái)防控病原菌的感染日益受到重視。噬菌體是一類能特異性侵襲細(xì)菌、支原體、螺旋體和真菌等病原體的病毒，自1915年由英國(guó)Twort發(fā)現(xiàn)后，就被用于研究細(xì)菌感染的防治。噬菌體個(gè)體微小，在地球上分布廣泛且種類豐富。人們普遍認(rèn)為噬菌體既對(duì)植物、動(dòng)物和人類無(wú)害和無(wú)耐藥性，也不會(huì)污染環(huán)境，安全性高[3]。噬菌體裂解酶最早于20世紀(jì)50年代得到確定，與噬菌體僅作用于病原菌一樣，裂解酶不會(huì)影響動(dòng)物體細(xì)胞，并不影響有益或無(wú)害的動(dòng)物寄生菌。相比抗生素和消毒劑，裂解酶具有更好的特異性，裂解譜又大于噬菌體的，通常認(rèn)為裂解酶攻擊細(xì)菌的速度極快，以致細(xì)菌很難對(duì)其產(chǎn)生抗性[4]。

因此，噬菌體及其裂解酶作為新型的天然抗菌劑和消毒劑具有一定的優(yōu)勢(shì)。本文重點(diǎn)介紹噬菌體及其裂解酶在家畜細(xì)菌性疾病防控中的相關(guān)研究進(jìn)展，展示噬菌體及其裂解酶在規(guī)?；】瞪a(chǎn)中良好的應(yīng)用前景。

1 噬菌體及其裂解酶替代抗生素和化學(xué)消毒劑的優(yōu)勢(shì)

近年來(lái)，為應(yīng)對(duì)消毒劑與抗生素濫用造成的超級(jí)細(xì)菌出現(xiàn)和動(dòng)物性食品藥物殘留等問(wèn)題，世界多國(guó)頒布了相關(guān)的法律法規(guī)或措施來(lái)推動(dòng)“無(wú)抗生素進(jìn)程”。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2017年6月頒發(fā)了《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃》。后抗生素時(shí)代即將來(lái)臨，噬菌體及其裂解酶的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)正好可以應(yīng)對(duì)抗生素和化學(xué)消毒劑所遇到的治療瓶頸，是首選的替代品。

噬菌體及其裂解酶能有效地感染和裂解其宿主菌，無(wú)殘留，無(wú)耐藥性，是天然的生物消毒劑與抗菌劑[5]。與抗生素和化學(xué)消毒劑相比，噬菌體及其裂解酶有很多顯著的優(yōu)勢(shì)[6]：不僅抗菌效果強(qiáng)，不易引起動(dòng)物源性致病菌產(chǎn)生耐藥性，特異性強(qiáng)，副作用少，安全性較高，自我增殖快，篩選周期短，研發(fā)成本低，而且種類極為豐富，取材方便，例如每1 mL水中噬菌體的含量可達(dá)2×108個(gè)[7]。還可針對(duì)性地篩選噬菌體與裂解酶用作預(yù)防性制劑。但迄今為止，已經(jīng)被分離和應(yīng)用的噬菌體數(shù)量非常有限。因此，裂解性噬菌體在控制致病菌感染和解決耐藥性問(wèn)題上有較大的開(kāi)發(fā)空間[8]。

飼養(yǎng)環(huán)境防疫消毒是控制、預(yù)防和消滅畜禽疫病的主要技術(shù)手段。噬菌體及其裂解酶是一類生物消毒劑，與物理消毒法和化學(xué)消毒法相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?；瘜W(xué)消毒法雖適用范圍廣，但存在諸多問(wèn)題，如穩(wěn)定性差、刺激性大、腐蝕性較強(qiáng)、易殘留污染環(huán)境和破壞生態(tài)等，而物理消毒法則使用范圍窄且清除不徹底。另外，由于物理消毒法與化學(xué)消毒法難以消除在環(huán)境中形成芽孢和耐藥的細(xì)菌，極大地限制了其在家畜生產(chǎn)上的應(yīng)用。噬菌體及其裂解酶憑借其滅菌高效、作用時(shí)間長(zhǎng)和安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[9]，能廣泛適用于地面、土壤、水體、空氣以及物體表面(如畜禽棚舍、籠具、器械和車輛)等，對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境中致病菌的防控具有重要意義。

動(dòng)物生產(chǎn)、食品保鮮加工和醫(yī)學(xué)臨床等領(lǐng)域不斷有一些噬菌體和裂解酶制劑獲得應(yīng)用，由此可見(jiàn)，噬菌體及其裂解酶制劑作為一種理想的致病菌防治途徑，其發(fā)展前景十分廣闊[10]。

2 噬菌體及其裂解酶防治家畜細(xì)菌性疾病的相關(guān)研究

在家畜的眾多細(xì)菌性疾病中，最常見(jiàn)且最廣泛的疾病是由感染大腸埃希菌引起的疾病。2007年，一種噬菌體已獲得美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用，對(duì)牛體隱蔽部位進(jìn)行噴灑和清洗，以減少飼養(yǎng)過(guò)程中大腸埃希菌的污染，這為在家畜的細(xì)菌性疾病防治中應(yīng)用噬菌體和裂解酶制劑鋪平了道路[11]。

Smith等英國(guó)學(xué)者開(kāi)展了利用兩種噬菌體及其混合制劑防治牛腹瀉性大腸埃希菌病的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，口服單一劑量105PFU/mL的噬菌體能有效治愈由大腸埃希菌O9:K30感染引起的初生牛犢腹瀉。而給未經(jīng)清潔的牛舍噴灑102PFU/mL的兩種噬菌體混合制劑后，也可起到很好的預(yù)防效果[12]。對(duì)試驗(yàn)牛犢的微生物檢測(cè)表明，噬菌體在牛犢小腸內(nèi)可迅速大量増殖，并高效殺滅大腸埃希菌，使其數(shù)量降到幾乎無(wú)害的范圍。

Smith等還研究了噬菌體對(duì)引起羊羔腹瀉的大腸埃希菌的控制作用。試驗(yàn)給出生8 h～16 h的羊羔口服感染致病性大腸埃希菌，8 h之后口服1010PFU/mL噬菌體雞尾酒制劑。檢測(cè)結(jié)果表明，該制劑能顯著減少羊羔小腸內(nèi)大腸埃希菌的數(shù)量，并可使腹瀉病死率降低28.6%[13]。

Wall等開(kāi)展了利用多種噬菌體混合制劑控制豬沙門菌感染的研究，試驗(yàn)以口服方式對(duì)出欄豬和3～4周齡仔豬接種噬菌體混合制劑。結(jié)果顯示，口服109PFU/mL混合制劑后，仔豬回腸、盲腸和扁桃體中的沙門菌數(shù)減少了99%～99.9%[14]，該制劑還能有效殺滅出欄豬回腸和盲腸中的沙門菌。

豬鏈球菌病是一直困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，龐亮亮嘗試以噬菌體療法解決這一難題。經(jīng)小鼠感染模型試驗(yàn)證實(shí)，噬菌體SMP療法對(duì)感染了豬鏈球菌的小鼠能起到很好的保護(hù)效果，這為噬菌體療法在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)[15]。

大腸桿菌O157:H7是一種人畜共患的食源性致病菌，反芻動(dòng)物是其主要宿主與傳染源。在反芻動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程中，噬菌體療法可有效控制大腸桿菌O157:H7在反芻動(dòng)物體內(nèi)的定植，有效降低該致病菌進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)[16]。Stanford等利用聚合物包裹噬菌體制成微囊，以抵抗外界的酸性環(huán)境。經(jīng)口服噬菌體微囊治療后，肉牛體內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量顯著減少[17]。這種新劑型為噬菌體在家畜生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

乳房炎是危及奶牛生產(chǎn)最常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病，金黃色葡萄球菌是其主要致病菌。李隴平等發(fā)現(xiàn)噬菌體對(duì)金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有顯著的預(yù)防作用[18]。孫利利等利用噬菌體治療奶牛乳房炎，試驗(yàn)在不使用抗生素的條件下通過(guò)乳頭管將106PFU/mL的金黃色葡萄球菌噬菌體輸入患病奶牛的乳室，經(jīng)2～5次處理，患病奶牛都可恢復(fù)正常的泌乳能力[19]。

當(dāng)前，噬菌體與裂解酶療法在防治家畜細(xì)菌性疾病方面的效果良好，有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但該技術(shù)還屬于探究階段，尚不成熟。隨著相關(guān)研究的深入和分子生物學(xué)技術(shù)的成熟，上述問(wèn)題必將得到逐步解決，噬菌體與裂解酶療法在規(guī)模化健康生產(chǎn)中將展示出更加廣闊的應(yīng)用前景。

3 噬菌體及其裂解酶對(duì)家畜飼養(yǎng)環(huán)境消毒相關(guān)研究

目前，我國(guó)因傳染病死亡的豬占6%～8%，每年造成上百億的經(jīng)濟(jì)損失。飼養(yǎng)環(huán)境消毒是對(duì)成本和疾病的有效控制，但傳統(tǒng)化學(xué)消毒劑的不當(dāng)使用和濫用必然會(huì)讓消毒劑如抗生素一樣出現(xiàn)耐藥性細(xì)菌，而且更為嚴(yán)重[20]，尤為重要的是對(duì)畜禽舍環(huán)境的消毒處理基本每周都要進(jìn)行，微生物的耐藥性會(huì)顯著影響消毒效果[21]，因此急需新型的生物消毒劑。

生物膜很容易生成并覆蓋在畜禽舍籠具、運(yùn)輸車輛、器械及料槽等物體表面，會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期的污染問(wèn)題。據(jù)研究，協(xié)同使用李斯特菌噬菌體和季銨鹽化合物能有效降低不銹鋼與聚丙烯表面李斯特菌的數(shù)量。有研究發(fā)現(xiàn)在水凝膠導(dǎo)管模型(銅綠假單和表皮葡萄球菌生物膜)上噴灑3種噬菌體的混合制劑，能顯著減少模型表面生物膜的生成與再生[22]。由此可見(jiàn)，利用噬菌體及其裂解酶對(duì)飼養(yǎng)設(shè)施及器械的預(yù)處理可有效提高安全性。

國(guó)內(nèi)外眾多動(dòng)物試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，噬菌體雞尾酒制劑可高效殺滅環(huán)境中和動(dòng)物體內(nèi)的大腸桿菌，從而有效控制大腸桿菌感染[23]。徐焰等進(jìn)行了噬菌體XY殺滅環(huán)境水樣內(nèi)大腸埃希氏菌效果的試驗(yàn)[24]，消毒效果十分顯著。

綜上所述，作為一種新型的生物消毒劑，噬菌體、裂解酶或其混合制劑(雞尾酒法)可有效抑制和殺滅空氣中和各種材質(zhì)表面上的致病菌，可滿足不同家畜生產(chǎn)環(huán)境的消毒需求。

4 噬菌體及其裂解酶治療研究趨勢(shì)

篩選裂解性強(qiáng)的噬菌體(如宿主譜廣，吸附速度快，繁殖速率高)，純化用于治療。由于噬菌體的特異性，不能滿足多重感染的治療，將多種病原菌的特異噬菌體混合制備成噬菌體“雞尾酒”制劑，或者聯(lián)合應(yīng)用抗生素與噬菌體，可拓寬裂菌譜。鑒于噬菌體治療存在的局限性如受機(jī)體免疫系統(tǒng)影響及特異性強(qiáng)，通過(guò)分子生物學(xué)手段重建噬菌體是噬菌體療法研究的核心事項(xiàng)。目前，隨著噬菌體表面展示技術(shù)日益成熟和應(yīng)用普遍，在特異性抗體的表達(dá)、特異性功能蛋白的制備以及基因工程載體的修飾等方面不斷顯示出其各種優(yōu)勢(shì)。此類分子克隆方法可結(jié)合噬菌體療法在防控多種家畜疫病方面發(fā)揮更好的免疫和治療作用。

裂解酶作為一種新型的抗菌藥劑，越來(lái)越多的經(jīng)原核表達(dá)方法純化的裂解酶被用于治療細(xì)菌性疾病，尤其是對(duì)常規(guī)方法或傳統(tǒng)方法難以防控的耐藥菌研發(fā)其高效的噬菌體裂解酶具有更加重要的現(xiàn)實(shí)意義。裂解酶對(duì)宿主細(xì)菌作用迅速，通過(guò)基因工程技術(shù)可以產(chǎn)生大量的酶，比噬菌體有更寬的裂解譜，具有更廣的應(yīng)用前景。對(duì)裂解酶進(jìn)行設(shè)計(jì)、改造與修飾等基因工程技術(shù)可解決裂解酶存在的某些不足。連接不同裂解酶的結(jié)合域與催化域，產(chǎn)生嵌合體裂解酶。該類裂解酶不僅有較廣的裂解譜，較高的滅菌活性，還能在不同pH環(huán)境中殺滅病原菌。此外，裂解酶還可和乙二胺四乙酸、檸檬酸和抗生素等聯(lián)合作用。上述方法不但拓寬了其裂解譜，而且提高了其裂解活性，使之成為解決耐藥性難題的有效途徑。

在蛋白質(zhì)工程和基因重組等生物技術(shù)發(fā)展迅速的今天，越來(lái)越多的科學(xué)家和企業(yè)家都深信在不久的將來(lái)，這一領(lǐng)域會(huì)不斷出現(xiàn)新的成果，并將迎來(lái)噬菌體及其裂解酶防控家畜細(xì)菌性疾病的新階段。