謝景春，謝保平，余麗梅

(1.于都縣人民醫(yī)院，江西 于都 342300；2.贛南醫(yī)學院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，江西 贛州 341000；3.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州省生物治療人才基地，貴州 遵義 563003)

人體內(nèi)定植了1013～1014不同的微生物，這些微生物也是影響我們健康的重要因素之一[1]。近十幾年來，隨著對腸道菌群(Intestinal microbiome，IM)研究的不斷深入，越發(fā)突出了IM在維持人類健康，腸道正常生理功能，如營養(yǎng)吸收、能量代謝及抵御腸道感染和促進免疫系統(tǒng)成熟等方面的關(guān)鍵作用[2]，而IM失衡與一些重大疾病密切相關(guān)，如結(jié)直腸癌、腸易激綜合征、類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肥胖和過敏等疾病。美國“國家微生物組計劃”和中國聯(lián)合全球12個國家發(fā)起全球微生物基因組測序計劃的提出，又使得微生物與疾病或藥物不良反應相關(guān)性的研究引起全世界的廣泛關(guān)注[3]。

干細胞移植是治愈血液系統(tǒng)惡性腫瘤和其它多種疾病的重要手段，接受同種異體造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplant，allo-HSCT)的患者由于其自身疾病以及廣泛接觸抗生素和放化學治療抑制異種排斥的關(guān)系[4]，而使得她們的IM結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，喪失了正常IM組成的屏障功能，削弱了對致病菌的抵抗作用，從而加重移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)和感染等并發(fā)癥，制約了allo-HSCT在臨床上的應用。因此，動態(tài)觀測、深入地研究人體IM變化以及它們?nèi)绾斡绊慳llo-HSCT并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展，對于提高allo-HSCT的療效與成功率，制定有效措施，防治不良反應發(fā)生具有重要價值。

1 腸道菌群和allo-HSCT并發(fā)癥的關(guān)系

1.1 IM失調(diào)與GVHD的關(guān)系GVHD是移植相關(guān)并發(fā)癥最嚴重的一種，它與腸道功能紊亂密切相聯(lián)系。早期研究IM的作用發(fā)現(xiàn)，在無菌環(huán)境中進行allo-HSCT后，小鼠死亡率和急性GVHD的發(fā)生率顯著降低[5]。在allo-HSCT治療過程中，發(fā)現(xiàn)使用亞胺培南-西司他丁全身治療會減少梭狀芽孢桿菌的豐度，并增加了丹毒絲菌 (Erysipelotrichia)和腸球菌的數(shù)量，加重GVHD的程度[4]，提示IM的改變對GVHD的發(fā)展具有重要作用。不僅如此，在骨髓移植后的小鼠和GVHD患者中，也發(fā)現(xiàn)梭菌及乳酸桿菌的減少；骨髓移植前清除小鼠腸道乳酸桿菌也可促發(fā)GVHD，當重新引入主要的乳酸桿菌時，GVHD癥狀得到緩解[6]，進一步研究發(fā)現(xiàn)allo-HSCT治療后細菌移位會觸發(fā)急性GVHD發(fā)生[7]，且發(fā)現(xiàn)活動性胃腸道(Gastrointestinal, GI) GVHD的患者IM中腸球菌的移位最為明顯[8]。

健康人的IM呈現(xiàn)高度多樣性，而allo-HSCT受者通常表現(xiàn)為細菌多樣性的下降[9]。allo-HSCT患者早期的放化療，使得IM多樣性在早期階段便顯示出大幅減少，其中包括梭菌和雙歧桿菌的減少及腸球菌的增加[10]。小鼠實驗還證明放療后細菌移位是導致嗜中性粒細胞向腸道組織募集的關(guān)鍵，嗜中性粒細胞的浸潤可介導活性氧進一步損傷局部組織，導致GVHD惡化[11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)從移植當天開始，患者表現(xiàn)低IM多樣性，其中腸球菌比例增加，其他厚壁菌門顯著減少。尤其在活躍性GVHD中，這些表現(xiàn)更為明顯，表明保護性和致病性細菌之間的不平衡可能是導致GVHD的因素[8]。另一項GVHD的研究也指出，當體內(nèi)梭狀芽孢桿菌類的布勞特氏菌屬(Blautia)占主導時，對GVHD的好轉(zhuǎn)有益[12]，而腸球菌增高則通過毒素介導的腸道炎癥和損傷對結(jié)腸上皮組織產(chǎn)生直接有害影響，并通過誘導巨噬細胞釋放TNF-α發(fā)揮效應，最終發(fā)展為GVHD[13]。因此用特異性細菌來作為GVHD發(fā)生、發(fā)展的預測或采用補充益生菌群，減輕或延緩GVHD具有十分可行的理論或?qū)嶒灮A(chǔ)。共生厭氧菌的減少，特別是抗炎梭菌的減少，腸球菌的大量擴增，以及用抗生素治療的GVHD小鼠效應CD4+T細胞浸潤增加和IL-23水平升高都與經(jīng)典的急性GVHD相關(guān)[4]。

其次，與腸上皮細胞(intestinal epithelial cells, IECs)損傷相關(guān)的宿主組織相容性復合體的抗原暴露增加也會促進急性GVHD的發(fā)展，具體而言，環(huán)磷酰胺能改變小腸中的IM組成，并誘導特定的革蘭氏陽性細菌轉(zhuǎn)移至腸道次級淋巴器官中，加強 “致病性”Th17細胞和Th1介導的特異性免疫應答發(fā)揮功能[14]。

最后，基因?qū)用嬉舶l(fā)現(xiàn)IM中的FUT2基因的改變會增加allo-HSCT后急性GVHD和菌血癥的風險[15]。也有研究表明細胞內(nèi)NOD2的宿主突變與急性GVHD相關(guān)，NOD2功能的喪失可能導致微生物感染控制失敗，從而引發(fā)全身反應和異常炎癥[16]。也就是說，IM的改變與allo-HSCT后GVHD并發(fā)癥出現(xiàn)息息相關(guān)。

1.2 IM失調(diào)與炎癥感染的相互作用炎癥感染是IM失調(diào)和免疫應答引起的移植相關(guān)并發(fā)癥常見的結(jié)局。allo-HSCT前的高劑量放化療也會使腸道穩(wěn)態(tài)受到干擾，導致腸道微絨毛的損失，緊密連接受損和IgA分泌減少，進而GI上皮完整性被破壞，方便病原菌定植進入血液循環(huán)，導致嚴重的炎癥感染并發(fā)癥。而在allo-HSCT后IM，炎癥感染和免疫反應之間卻具有復雜和多方向性相互作用的關(guān)系[17]。

高劑量放化療會引起黏膜損傷，導致炎癥細胞因子的釋放，包括TNF-α、I型干擾素、IL-1和IL-6，這些炎癥細胞因子可直接改變IM的組成，上調(diào)主要組織相容性復合體和免疫共刺激分子的表達，從而促進GVHD和炎癥感染的發(fā)生[18]。組織損傷又增加了腸道的通透性，可使內(nèi)毒素在腸黏膜中無障礙性轉(zhuǎn)運，進一步激活了宿主的先天免疫系統(tǒng)及細胞因子釋放。

現(xiàn)已證明，清髓或非清髓處理的allo-HSCT及使用免疫抑制劑后，IM多樣性減少，丁酸鹽的缺乏以及梭菌屬IV和XIVa的相對豐度減少與腸道炎癥強度呈負相關(guān)[19]，而腸球菌豐度的增加與炎癥程度呈正相關(guān)[20]。艱難梭菌感染(Clostridiumdifcileinfection, CDI)作為allo-HSCT最常見的并發(fā)癥之一，患者發(fā)病率在10%～15%之間[21]，CDI通常是使用廣譜抗生素和化療導致的后遺癥，有研究表明allo-HSCT受者的CDI比率高于自體移植患者[22]。小鼠模型證明梭狀芽孢桿菌可通過產(chǎn)生繼發(fā)性膽汁酸，抑制艱難梭菌的生長和毒素產(chǎn)生，有效防止CDI的發(fā)生[23]。同時CDI也是allo-HSCT受者感染性腹瀉的常見因素，據(jù)報道發(fā)病率約為15%～20%[24]。另外allo-HSCT后IM失調(diào)常常也出現(xiàn)菌血癥[10]和GVHD癥狀[25]，這些都說明了IM的改變也是移植后炎癥感染并發(fā)的重要潛在誘因。

2 腸道菌群調(diào)節(jié)allo-HSCT并發(fā)癥的免疫機制

以往的研究資料證明，革蘭氏陰性細菌外壁層中的脂多糖會通過Toll樣受體(Toll-like receptors 4, TLR4)信號啟動GVHD過程，刺激嗜中性粒細胞浸潤產(chǎn)生活性氧來介導局部組織損傷，導致GVHD惡化[11]。提示IM通過免疫應答調(diào)節(jié)allo-HSCT并發(fā)癥。腸道免疫系統(tǒng)依賴于完整微生物群強直信號的傳導來發(fā)揮最佳功能。受微生物組影響的免疫細胞包括固有淋巴細胞、嗜中性粒細胞、DC細胞、T細胞和B細胞以及NK細胞。所以從免疫調(diào)節(jié)角度探討移植并發(fā)癥與IM之間的關(guān)系也是非常關(guān)鍵的。

動物實驗顯示，在無菌條件下生長的小鼠不具有正常的免疫系統(tǒng)，易遭受病原菌感染，而抗生素攝入會增加條件致病菌的定植和致病性[26]。其機制可能是共生菌與代謝相關(guān)的病原體腸內(nèi)競爭營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。另一種可能的機制是共生菌對粘蛋白產(chǎn)生有促進作用。正常情況下，杯狀細胞產(chǎn)生的粘蛋白所形成粘液層作為物理屏障可以抑制病原體侵入，而無菌小鼠的粘液層比正常小鼠薄得多[27]，導致病原菌侵入更為順暢，機體的防御越發(fā)脆弱，說明了共生菌在體內(nèi)是相輔相成的，某一方失衡都會引起免疫系統(tǒng)紊亂，進而不利于移植效果的穩(wěn)定及促進多種不良反應的發(fā)生。

固有的淋巴細胞(Innate Lymphoid Cells，ILC)作為免疫效應物，是對抗病原體的第一道防線。ILC具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和組織再生作用，特別是在粘膜表面能加強IECs的緊密連接性。ILC也能產(chǎn)生集落刺激因子2來應答巨噬細胞衍生的IL-1β，刺激DC產(chǎn)生視黃酸以促進Treg的募集發(fā)揮免疫作用[28]。研究發(fā)現(xiàn)ILC1在IL-12的刺激下能分泌IFN-γ和TNF-α來響應腸道感染[29]；ILC2則能在慢性炎癥區(qū)域分泌組織再生所必須的雙調(diào)蛋白；而NKp44陽性ILC3則在IL-23信號刺激下產(chǎn)生組織保護性細胞因子IL-22，抑制局部和全身炎癥來調(diào)節(jié)共生菌[30]。由此可知，它們在維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡和腸上皮再生方面具有重要作用。此外，IL-22也可觸發(fā)AMP的釋放來促進IECs再生，保持上皮的老化更新來促進屏障的完整，IL-22治療后小鼠腸GVHD發(fā)病率和死亡率降低，也說明作用機制與IL-22促進腸干細胞介導的IECs再生有關(guān)[31]。

其次，特定的IM還可以促進T細胞分化，如梭菌物種產(chǎn)生的短鏈脂肪酸已被證明可促進叉頭蛋白3(forkhead box protein，F(xiàn)oxp3)誘導Tregs的擴增或分化，也可通過上調(diào)TGF-β以支持FoxP3的誘導來識別微生物抗原[32]。腸球菌的增加，梭菌的減少使得病原相關(guān)分子通過IL-1和IL-6誘導炎癥反應加強后，產(chǎn)生的級聯(lián)信號進而會激活Th1和Th17的適應性免疫應答[8]；這種反作用致使 Tregs也通過抗炎細胞因子IL-10在GI穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，或者直接影響巨噬細胞快速應答以保護機體[32]。

此外，共生菌還能調(diào)節(jié)粘膜免疫系統(tǒng)中的自然殺傷性T細胞的發(fā)育和成熟，誘導的Treg細胞以及效應T細胞向腸固有層中的抗原位點募集[33]。這種將IM與T細胞功能連接的潛在分子機制還可能與DC和巨噬細胞表達的催化色氨酸降解的初始限速酶吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)有關(guān)，因為IFN-γ等炎癥性細胞因子也可誘導IDO，并通過消耗色氨酸抑制T細胞活化，并上調(diào)Tregs誘導免疫耐受，而共生細菌產(chǎn)生的丁酸鹽可通過IECs中的雙重機制下調(diào)IDO的表達[34]，提示微生物群在調(diào)節(jié)IDO中發(fā)揮一定作用。

B細胞也參與了腸道免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。有數(shù)據(jù)證明共生菌能夠影響腸道固有層早期B細胞譜系的發(fā)育，并且由IECs分泌的細胞因子以T細胞依賴性方式介導B細胞產(chǎn)生IgA，穿過上皮屏障進入腸腔，亦為另一條防治微生物紊亂的重要防線[35]。

3 調(diào)節(jié)IM改善Allo-HSCT并發(fā)癥的臨床治療

外在條件和宿主本身可以影響微生物的組成，導致IM多樣性的波動，影響移植后并發(fā)癥的發(fā)生。這些因素包括年齡、飲食方式的改變、抗生素使用、炎癥、代謝產(chǎn)物和壓力[2]。因此針對性采取措施可能是改變移植后效果的可靠方式。

3.1飲食飲食方式的改變在影響IM組成方面也扮演著重要角色。allo-HSCT后飲食方式的不同可能導致GVHD的發(fā)展，數(shù)據(jù)顯示接受全腸外營養(yǎng)的小鼠和人受試者會表現(xiàn)出INF-γ的增加，以及IL-4、IL-10、腸道CD4+細胞減少的現(xiàn)象，這很可能就是促炎癥反應的免疫應答方式，而在allo-HSCT的患者中，轉(zhuǎn)而慢慢采用腸內(nèi)喂養(yǎng)的飲食方式，可降低Ⅲ～Ⅳ級GVHD和感染事件[36]。此外，腸內(nèi)補充低聚糖，纖維和谷氨酰胺，對接受allo-HSCT的患者具有降低死亡率和腸球菌移位的趨勢[37]。在環(huán)境因素方面數(shù)據(jù)也顯示，allo-HSCT后在家接受護理與在醫(yī)院調(diào)養(yǎng)相比，Ⅱ～Ⅳ級急性GVHD的發(fā)生率較低[38]，說明暴露于醫(yī)院環(huán)境也可能對IM產(chǎn)生不利影響。

3.2抗生素抗生素治療可能是影響allo-HSCT過程中IM多樣性破壞的主要因素[10]。研究顯示口服環(huán)丙沙星和廣譜抗生素的患者易出現(xiàn)腸球菌增加及共生菌主導力的下降[39]。共生菌作為AMP的重要誘導物，長期抗生素治療，會使得Paneth細胞產(chǎn)生的抗微生物活性的C型凝集素-再生胰島蛋白3a(regenerating isletderived 3-alpha)等特異性AMP的誘導下降，抑制腸球菌過度生長的作用就會減弱，IM多樣性的維持反而不佳。在回顧性研究中，發(fā)現(xiàn)allo-HSCT患者使用利福昔明可以保護腸道多樣性，并與環(huán)丙沙星和甲硝唑聯(lián)合治療的患者相比，其移植相關(guān)死亡率更低[40]，可能是利福昔明在一定程度上可以保留某些有益的厭氧腸道微生物，不影響微生物群的總體組成有關(guān)。廣譜抗生素雖可減少細菌毒力因子的表達，病原體的粘附和炎性細胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)腸道炎癥，但是它也會加重IM多樣性的喪失。據(jù)推測，共生厭氧生物如梭狀芽孢桿菌可能有助于維持和恢復IM多樣性，并且使用耐厭氧菌的抗生素可能有益于患者[41]。但會引發(fā)多藥耐藥菌的定植[42]，因此研發(fā)單一穩(wěn)定的靶向抗生素依然是當務(wù)之急。

3.3益生元和益生菌益生元在調(diào)節(jié)IM的方面，主要表現(xiàn)為抑制腸道致病菌與上皮的粘附，增強腸上皮的抗感染和抗炎作用。益生元作為一種難消化的碳水化合物，在共生菌的發(fā)酵下產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如丁酸鹽、醋酸鹽和丙酸鹽，然后被用作能量來源促進IECs的健康。其中一些短鏈脂肪酸能通過誘導Treg細胞來產(chǎn)生一些抗炎性的細胞因子，在抗炎性通路上調(diào)節(jié)GVHD的發(fā)生和嚴重程度[32]。又一研究證實allo-HSCT后的小鼠黏膜組織中丁酸鹽水平含量降低，可能與組蛋白乙?；瘻p少和IECs凋亡增加有關(guān)，而給予丁酸鹽治療可減少腸道損傷和GVHD，其機制可能與增加跨上皮的電阻和降低菊糖滲透性促進腸壁屏障功能有關(guān)[25]。共生菌產(chǎn)生的3-吲哚酚硫酸鹽(3-indoxyl sulfate，3-IS)是由結(jié)腸細菌中的毛螺菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)產(chǎn)生的一種L-色氨酸代謝產(chǎn)物，在IM中起細胞間信號作用，調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能或IECs中表達促炎和抗炎特性。與晚期抗生素治療相比，早期使用抗生素會降低3-IS水平和共生梭菌的豐度[43]，說明allo-HSCT后早期低3-IS水平是微生物群被破壞的標志，并可導致移植相關(guān)的高死亡率[7]。

益生菌則在增加Treg細胞數(shù)量的同時上調(diào)TGF-β水平來降低CD4+/CD8+T細胞的作用賦予宿主獲益[44]。

乳酸桿菌作為良好的益生菌來源，可以改善移植后的急性GVHD和腸道炎癥發(fā)生。前期有人觀察到，在移植前后接受鼠李糖乳桿菌GG的小鼠，可減少病原菌移位進入腸系膜淋巴結(jié)，局部組織學炎癥和GVHD減輕，然而這也存在爭議，有報道指出，用鼠李糖乳桿菌GG補充治療的allo-HSCT患者并未顯著改變IM多樣性，也未改變GVHD的發(fā)生率或嚴重程度[45]，這可能與Elan等研究的樣本量較小有關(guān)。

3.4糞菌移植糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT) 是一種通過重建IM來治療疾病的方法。在恢復IM物種多樣性喪失或減少方面，F(xiàn)MT被認為是很好的益生菌來源，而且在難治性或復發(fā)性CDI中的療效已經(jīng)明確。研究提示，F(xiàn)MT可以根除受者GI中抗生素抗性細菌的定植，而且對于恢復allo-HSCT前后導致的梭菌降低十分有益。此外，減少抗生素的使用有利于提高FMT的效果[46]。另一方面FMT對于激素抵抗型GVHD的改善也有幫助[47]，然而，F(xiàn)MT的臨床研究還需要更為多樣的益生菌移植加以驗證，并需要更大樣本量的臨床試驗加以深入闡釋、實證。間充質(zhì)干細胞聯(lián)合allo-HSCT移植，不但可明顯提高HSCT的療效，還可大大降低或延緩GVHD的發(fā)生或減輕其臨床癥狀，間充質(zhì)干細胞的移植是否也明顯影響自身免疫性疾病等的IM還需要進一步開展研究。

4 展 望

人體IM的變化對allo-HSCT后并發(fā)癥的影響使人們更加關(guān)注腸道功能紊亂的潛在標志。除了對IM失調(diào)的監(jiān)測外，還應對關(guān)注飲食、生活方式、種族和環(huán)境因素對IM的影響。雖然我們對IM在人類健康中的角色做了很多探索，但具體機制和非細菌性病毒體的研究尚十分有限。病毒體與菌群基因的改變可能也是誘發(fā)潛在感染的重要線索，潛在感染一旦發(fā)生，勢必引發(fā)更嚴重的腸道感染和免疫應答失調(diào)，對干細胞移植治療效果及其并發(fā)不良反應的影響可能會十分突出，因此加強針對IM失調(diào)全面而深入的探索對于提高療效、降低不良反應具有重要意義。隨著干細胞移植技術(shù)的改進和IM精準醫(yī)學檢測的發(fā)展，及IM與allo-HSCT后不良反應發(fā)生關(guān)系認識的深入，未來將會有更多的策略來改變IM失調(diào)，改善allo-HSCT效果，為臨床治療移植后嚴重并發(fā)癥提供更好的防治措施。