楊文濤 關德宏
微RNA(miRNA)是短鏈非編碼RNA分子,長度為19~25個核苷酸,廣泛存在于生物體內[1],是一種特殊的生物調節(jié)因子。成熟的miRNA可與目標信使RNA發(fā)生堿基互補配對,并誘導目標信使RNA降解或抑制其翻譯,調控靶基因表達水平[2-3]。研究證實,miRNA對細胞的增殖、遷移和分化有重要調節(jié)作用,在骨發(fā)育和骨再生中也發(fā)揮重要調控作用[4]。
隨著人口老齡化日益嚴重,交通運輸業(yè)不斷發(fā)展,骨科疾病發(fā)病率逐年攀升,大面積骨缺損、骨不連的發(fā)生率也有所上升。目前,自體骨移植依然是治療骨缺損的首選方法[5],但存在骨供應量有限,給患者帶來額外痛苦等缺點,而miRNA的發(fā)現(xiàn)則為這些難治性骨折的治療提供了新思路。本文對miRNA在骨損傷診療中的研究進展作一綜述。
miRNA與骨密度降低、骨質疏松、骨折等骨科疾病均存在密切聯(lián)系,骨折發(fā)生和愈合過程中涉及各種調節(jié)因子,包括miRNA[6-7]。
Gautvik等[8]進行骨折風險研究,他們選取不同部位共102例活體骨樣本,通過聚合酶鏈式反應分析和miRNA芯片技術檢測相關miRNA含量,并進行對比分析,最后確定28個miRNA的表達水平與骨折相關。他們進一步分析發(fā)現(xiàn),其中5個miRNA(miR-484、miR-328-3p、miR-27a-5p、miR-28-3p和miR-409-3p)與骨密度正相關,即這5個miRNA水平降低會增加骨折發(fā)生風險。不過,該研究中研究對象均為絕經后婦女,5個miRNA是否與雌激素相關,其變化是否適用于所有性別和年齡的人群,還需深入研究。
Chen等[9]對30例骨質疏松性骨折患者的骨折碎片進行研究,同時以30例行髖關節(jié)置換的骨關節(jié)炎患者的股骨頸區(qū)骨樣本作為正常對照組,發(fā)現(xiàn)骨質疏松性骨折患者骨折碎片樣本中miR-135b-5p表達水平明顯高于對照組。進一步的體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),miR-135-5p可通過調控骨特異性轉錄因子(Runx)2抑制成骨細胞的增殖和分化。該研究直接以骨質疏松性骨折患者的骨折碎片作為研究樣本,極具代表性,但對照組與正常人骨骼樣本的差異可能對研究結果存在影響,對此還需進一步探究。
以上兩項研究中均采用人體骨組織作為樣本,這限制了樣本采集和miRNA的實時監(jiān)測,但研究結果對骨科疾病的探索仍具有深刻意義。
相對于骨組織樣本,血液樣本易采集,且一定意義上可做到miRNA實時監(jiān)測。Mandourah等[10]提取正常人、骨質疏松患者、骨質疏松性骨折患者共139例志愿者的血液樣品,利用RNA測序技術對370個miRNA進行高通量篩選,發(fā)現(xiàn)40個miRNA出現(xiàn)差異性表達,最終確定miR122-5p和miR-4516表達水平下降與骨質疏松性骨折的發(fā)生存在密切聯(lián)系。
Kocijan等[11]對153例骨折患者(絕經前女性46例、絕經后女性52例、男性55例)血液中187個miRNA進行聚合酶鏈式反應定量分析,發(fā)現(xiàn)骨折患者血清中miR-152-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p、miR-324-3p、miR-19b-3p、miR-335-5p、miR-19a-3p和miR-550a-3p 的水平有明顯改變,且與患者的年齡和性別無關。
Feichtinger等[12]進行骨折風險預測研究。他們提取36例輕度骨折患者的血漿,通過RNA測序、實時聚合酶鏈式反應定量分析等技術對可能產生影響的19個miRNA進行分析,發(fā)現(xiàn)多個miRNA對骨組織微結構有影響,其中miR-29b-3p、miR-324-3p和miR-550a-3p的表達水平降低,且與骨密度降低直接相關。該研究提示,一些miRNA的表達水平在骨折高風險人群(骨質疏松患者)、骨折患者與健康人中出現(xiàn)明顯差異,這或可用于評估骨折風險。
以上研究包含了各年齡段和性別的患者,并實現(xiàn)一定程度上的實時監(jiān)測,但人體血清成分復雜,其變化的影響因素也較多。
miRNA在細胞的特定時期表達,并能靶向調節(jié)組織細胞的分化、增殖、凋亡和遷移等過程[13]。骨組織的再生和血管化過程涉及干細胞的增殖、分化和遷移,miRNA參與這些過程中[14-15]。
骨的形成和再生主要依賴于間充質干細胞(MSC)向成熟成骨細胞分化[16],這一基本步驟的實現(xiàn)需激活包括轉化生長因子(TGF)-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)和Wnt等在內的多種信號轉導通路,這些信號轉導通路均受miRNA調控[17]。以上信號轉導通路的激活常導致下游核蛋白的表達,如Runx2、Osterix蛋白和環(huán)腺苷酸依賴性轉錄因子-4,它們可調控成骨細胞的發(fā)育。
Yang等[18]將經miR-21修飾的骨髓間充質干細胞(BMSC)/β-磷酸三鈣復合材料用于填補動物骨缺損模型。術后6個月顯微CT檢查發(fā)現(xiàn)新骨形成較好,進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-21可通過磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K )/蛋白激酶B(Akt)/低氧誘導因子-1α途徑促進骨再生,他們認為miR-21在體外可促進BMSC的遷移和成骨分化。Sun等[19]的動物實驗證實,miRNA-21過表達可增加BMSC中骨橋蛋白和堿性磷酸酶(ALP)的表達,從而促進成骨,加速骨折愈合。
Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn),miR-26a可促進BMSC的骨鈣沉積,提高ALP和骨鈣素的水平,他們認為miR-26a有促成骨分化的作用。此外,他們將miR-26a用于骨不連的大鼠模型中,X線檢查、蘇木精-伊紅染色和Masson染色實驗均表明,miR-26a可明顯增強成骨效果。實驗還對miR-26a促進骨折愈合的分子機制進行研究,結果顯示miR-26a通過Wnt/β-catenin信號轉導通路,靶向抑制含骨硬化蛋白結構域蛋白1的表達,促進MSC的成骨分化,從而促進骨不連的愈合。
Zhang等[21]在體外成骨細胞培養(yǎng)實驗中加入miR-218,采用蛋白質印跡法和細胞計數(shù)檢測發(fā)現(xiàn),miR-218可促進Runx2表達,從而促進成骨細胞成熟。Shi等[22]進行了進一步研究,他們將過表達miR-218的BMSC移植至股骨骨折小鼠模型中,通過X線和顯微CT檢查,機械測試,組織染色檢測發(fā)現(xiàn),miR-218可加速骨折愈合。
Ge等[23]研究發(fā)現(xiàn),在骨折早期小鼠體內miR-374b的表達水平明顯增高。隨后的體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),給予miR-374b,MSC中的ALP活性增加,成骨相關基因和蛋白的表達也明顯增加,而利用抗miR-374b敲低miR-374b表達則出現(xiàn)相反結果。進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-374b可通過降解PTEN促進MSC的成骨分化,從而促進骨折愈合。
綜上所述,miRNA在骨折愈合過程中發(fā)揮重要調控作用,通過調節(jié)部分miRNA的表達可促進成骨作用,最終達到改善骨折愈合的效果。miRNA在骨折延遲愈合、骨不連和骨缺損的治療中具有潛在的應用價值。
骨折通常伴有微血管破壞,形成局部低氧環(huán)境,這會刺激血管再生相關因子分泌,從而促進血管系統(tǒng)重建[24]。骨折后,新生血管可為局部組織提供營養(yǎng),還可運輸骨折修復所需的調控因子[25],miRNA便是其中之一。血管生成常與成骨作用一起促進骨折愈合[14]。
一項體外細胞研究發(fā)現(xiàn),含鋰的生物陶瓷材料(Li-BGC)可直接促進人臍靜脈內皮細胞的成血管能力[26]。隨后的動物研究發(fā)現(xiàn),Li-BGC也可促進新生血管向骨內生長。進一步研究證實,Li-BGC能促進BMSC生成含miR-130a的外泌體,外泌體中的miR-130a作用于人臍靜脈內皮細胞,使Akt和核因子-κB(NF-κB)通路激活,PTEN蛋白表達下調,從而促進人臍靜脈內皮細胞的增殖和遷移,最終促血管生成。該過程中,miRNA參與BMSC與血管內皮細胞之間的信號傳導和反饋調節(jié),同時具有促血管生成和促骨再生的作用。
Yan等[27]將MSC層整合到鈦合金上,形成MSC片-植入物復合物(MSIC),用于研究抗miR-138對復合體的影響。他們發(fā)現(xiàn),抗miR-138具有促血管生成和骨鈣沉積的作用。在小鼠皮下植入MSIC進行進一步研究發(fā)現(xiàn),與加入miR-138和生理鹽水相比,加入抗miR-138的MSIC可形成更為堅固的血管化骨組織,他們認為抗miR-138具有促血管生成和促進骨再生的作用。
Wang等[28]進行成骨細胞和H-型內皮細胞共培養(yǎng)實驗,應用miRNA測序技術分析證實miR-143在血管生成以及成骨過程中具有重要作用。隨后的臨床實驗發(fā)現(xiàn),老年骨折患者血清中miR-143的表達水平低于年輕患者。動物實驗發(fā)現(xiàn),miR-143敲除小鼠中H-型血管生成和成骨細胞分化受到明顯抑制,其給予基因敲除小鼠蛋白脫乙酰酶(HDAC)7可改善血管生成和骨再生,推測miR-143靶向作用于HDAC7以促進成血管細胞和成骨細胞的分化。
以上研究表明,miRNA在MSC和血管相關細胞中起著重要調控作用,可影響骨折過程中的血管生成和成骨作用。骨愈合過程中BMSC和血管相關細胞常相互聯(lián)系[29],其聯(lián)系機制也值得深入研究。
miRNA與骨折及骨愈合有著密切聯(lián)系,血循環(huán)中的部分miRNA也會隨著骨折的發(fā)生和發(fā)展出現(xiàn)變化。部分與骨質疏松性骨折相關的miRNA或可作為預測骨折風險的評估指標[30]。雖然骨愈合延遲及骨不連與患者的年齡以及骨折部位有關,但尚缺少客觀的預測指標,骨折患者血液或骨折碎片中的miRNA水平或可作為參考,這有利于對高風險人群提前制定更為合理且有效的診療決策。
miRNA除可應用于疾病診斷中,在骨愈合延遲、骨不連和骨缺損的治療方面也有巨大應用潛力[7]。動物實驗發(fā)現(xiàn),miRNA單獨應用或與干細胞、生物材料聯(lián)合應用,均能發(fā)揮良好的促骨愈合作用,但考慮到應用安全性,對miRNA相關的輔助治療以及臨床應用仍需開展進一步的研究和評估。
隨著生物技術的不斷發(fā)展,學者們開始注意到miRNA的潛在診療價值。涉及miRNA治療的專利逐年增加,開展相關研究的生物制藥公司不斷增多。目前,大多數(shù)miRNA相關藥物仍處于Ⅰ期臨床試驗階段。盡管miRNA在骨科領域應用的研究遠落后于心血管疾病、癌癥以及慢性傷口愈合等領域[31-32],但隨著研究的進一步開展,miRNA可能在骨相關疾病的診斷與治療中得到更多應用。