陳達(dá)艷 顧萬紅 馬新?lián)Q
甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州730050
支氣管哮喘是臨床比較常見的疾病。哮喘屬于中醫(yī)“哮病”范疇,風(fēng)痰阻肺是其病機(jī)。三子養(yǎng)親湯來源于《韓氏醫(yī)通》,具有祛風(fēng)化痰、降氣平喘的功效。藥理研究發(fā)現(xiàn)[1],三子養(yǎng)親湯具有抗炎、止咳、平喘、祛痰的藥理作用,作為治療支氣管哮喘的常用方劑。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來發(fā)展起來的新型學(xué)科,已被廣泛用于中藥活性成分的篩選、作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)、中藥作用機(jī)制及疾病發(fā)生機(jī)制的推測(cè)[2-4]。分子對(duì)接技術(shù)被用于理論驗(yàn)證受體與藥物分子之間結(jié)合模式和親合力[5-8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),探討三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的潛在治療作用,為三子養(yǎng)親湯的臨床應(yīng)用和研究提供新的思路。
1.1 三子養(yǎng)親湯活性成分的搜集、篩選和成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)以“紫蘇子”“萊菔子”“芥子”為關(guān)鍵詞,檢索各中藥的化學(xué)成分,并以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為篩選條件,得到活性成分[5-8]。同時(shí),在TCMSP數(shù)據(jù)庫Targets Information項(xiàng)下得到活性成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白,并借助Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為基因名。
1.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/),獲取支氣管哮喘的靶點(diǎn)基因。
1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用R軟件,獲取疾病與成分的共同靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線軟件,物種選為homo sapiens,最高置信度設(shè)置為0.9,去掉游離節(jié)點(diǎn),獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?,以種節(jié)點(diǎn)度(degree)值大于中位數(shù)作為篩選條件,確定關(guān)鍵靶點(diǎn),探討三子養(yǎng)親湯的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和治療支氣管哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn),并建立三子養(yǎng)親湯藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。
1.4 GO和KEGG分析 使用David[9](https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。GO分析選擇生物過程(BiologiclProcess,BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)3個(gè)模塊繪制成條形圖,并以P<0.05作為顯著功能與通路的臨界值。通過R軟件,安裝相應(yīng)的安裝包,將生物通路圖制成氣泡圖。
1.5 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接 分別從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)和Pub Chem數(shù)據(jù)庫(https://pub chem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)和化合物的3D結(jié)構(gòu),并轉(zhuǎn)化為Pdb格式;使用AutoDock軟件分別加氫、加電子等操作,分子對(duì)接設(shè)置蛋白結(jié)構(gòu)為剛性大分子,分子為柔性,算法為Genetic Algorithm;用Pymol對(duì)得到的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行繪圖。參照文獻(xiàn),以結(jié)合能≤-5.0kJ/mol[5-8]的成分作為三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的活性成分篩選依據(jù)。
2.1 三子養(yǎng)親湯活性成分篩選 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫,結(jié)合“OB≥30%”與“DL≥0.18”檢索到紫蘇子、萊菔子、芥子中活性化合物共22個(gè),其中16個(gè)來自紫蘇子,3個(gè)來自萊菔子,3個(gè)來自芥子。見表1。
2.2 三子養(yǎng)親湯活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 從TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到的紫蘇子、萊菔子、芥子的靶點(diǎn),利用Prel處理,獲得三子養(yǎng)親湯的活性靶點(diǎn)201個(gè),其中179個(gè)來自紫蘇子,18個(gè)來自芥子,4個(gè)來自萊菔子。
2.3 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索支氣管哮喘,共得到2210個(gè)與支氣管哮喘相關(guān)的靶點(diǎn)。
2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 用R軟件建立“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)與“疾病靶點(diǎn)”相互交集的韋恩圖,見圖1。共有93個(gè)交集靶點(diǎn),是三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的候選靶點(diǎn),其中NCOA2、ADRA1A、ADRA1B、AR、CHRM1、CHRM2、CHRM3、OPRM1、PTGS1、PTGS2為紫蘇子和芥子的共同靶點(diǎn)基因;NCOA2、NR3C2、PGR為紫蘇子和萊菔子的共同靶點(diǎn)基因。用Cytoscape 3.7.2軟件建立三子養(yǎng)親湯藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)包括106個(gè)節(jié)點(diǎn),249條邊,見圖2。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋?,網(wǎng)絡(luò)中度值>中位數(shù)(中藥度值中位數(shù)=6,成分度值中位數(shù)=19,靶點(diǎn)度值中位數(shù)=6)的藥材有1個(gè)(紫蘇子),成分有4個(gè),靶點(diǎn)有5個(gè)。排名前3位的化合物分別是MOL000006-木犀草素、MOL001439-花生四烯酸、MOL002773-β-胡蘿卜素,度值分別為44、25、22,均來自紫蘇子;排名前3位的靶點(diǎn)分別是NCOA2、PGR、PTGS2,度值分別為12、11、10,為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。見表2。
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2.5 靶點(diǎn)通路分析 利用DAVID在線工具對(duì)三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的93個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析(P<0.05)。GO分析得到條目523個(gè),其中生物過程(BP)396個(gè),細(xì)胞組成(CC)53個(gè),分子功能(MF)74個(gè),分別占76%、10%、14%。在生物過程中,凋亡過程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、一氧化氮生物合成過程正調(diào)控(positive regulation of nitricoxide biosynthetic process)、血管收縮正調(diào)控(positive regulation of vasoconstriction)等排位靠前;在細(xì)胞組分中,膜筏(membraneraft)、細(xì)胞外間隙(extracellular space)、胞質(zhì)溶膠(cytosol)等排在前面;在分子功能中,主要包括酶結(jié)合(enzyme binding)、同一蛋白結(jié)合(identical protein binding)、蛋白質(zhì)異二聚活性(protein heterodimerization activity)等。選取排名前20位的條目繪制成條形圖,見圖3。
圖1 VEEN圖
圖2 三子養(yǎng)親湯藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)
圖3 Go富集分析
KEGG通路分析結(jié)果顯示,富集于144個(gè)信號(hào)通路中,以排位前20條信號(hào)通路(P<0.05)繪制的高級(jí)氣泡圖及柱狀圖見圖4。結(jié)果顯示三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘KEGG通路分別與PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、人巨細(xì)胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、癌癥中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)等多條通路有關(guān),其中PI3K-Akt信號(hào)通路涉及CHRM1、CHRM2、RELA、CCND1、MAPK1等基因;人巨細(xì)胞病毒感染涉及PTGS2、RELA、CCND1、MAPK1、CASP3等基因;卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染涉及PTGS2、RELA、CCND1、MAPK1、CASP3等基因;癌癥中的蛋白聚糖涉及PLAU、CCND1、MAPK1、CASP3、COL1A2等基因;前列腺癌涉及PLAU、RELA、CCND1、MAPK1、EGF等基因。見圖4、5。這些通路與支氣管哮喘的形成機(jī)制有著密切的聯(lián)系,有研究顯示這些通路直接或間接介導(dǎo)并參與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程。上述結(jié)果表明三子養(yǎng)親湯主要化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)過程多樣化,并分布于不同的代謝通路,體現(xiàn)了其多成分,多靶點(diǎn),多途徑的治療特點(diǎn)。
2.6 分子對(duì)接結(jié)果 將3個(gè)核心活性化合物木犀草素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素分別與3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)NCOA2、PGR、PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接。以結(jié)合能≤-5.0kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn),可知,三子養(yǎng)親湯中木犀草素、β-胡蘿卜素與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能均小于-5.0kJ/mol,構(gòu)象能量低,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,結(jié)合活性較高。見表2和圖6。
圖4 KEGG富集分析的20條通路(氣泡圖及柱狀圖)
圖5 PI3K-Akt信號(hào)通路
3.1 三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘活性成分 本研究共篩選出三子養(yǎng)親湯中可被口服吸收的22個(gè)活性成分,其中16個(gè)來自紫蘇子,3個(gè)來自萊菔子,3個(gè)來自芥子。紫蘇子化合物中,黃酮類化合物有木犀草素,脂肪酸類化合物有花生四烯酸、順式-11-二十碳烯酸、二十碳三烯酸,甾醇類化合物有β-谷甾醇、豆甾醇、菠甾醇,脂肪族化合物有2,6,10,14,18-五甲基-2,6,10,14,18-戊烯、24-甲基異戊酚等。研究表明紫蘇葉的揮發(fā)油成分、黃酮類和酚酸類化合物是其抗炎活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ),已明確的活性成分有木犀草素。三子養(yǎng)親湯平喘配伍量效關(guān)系研究結(jié)果[10]表明,紫蘇子是方中平喘的主要中藥,且平喘效果與用量有關(guān)聯(lián)性。另有研究表明[11],三子養(yǎng)親湯的平喘作用優(yōu)于各單味藥,紫蘇子的平喘作用強(qiáng)于芥子,芥子的祛痰作用強(qiáng)于紫蘇子,萊菔子的鎮(zhèn)咳作用較強(qiáng)。這與本研究篩選出的結(jié)果相吻合,也與三子養(yǎng)親湯的傳統(tǒng)功效一致,是三子養(yǎng)親湯傳統(tǒng)功效的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ),也是三子養(yǎng)親湯質(zhì)量標(biāo)志物篩選的主要途徑和重要依據(jù)。
表2木犀草素、β-胡蘿卜素、花生四烯酸與NCOA2、PGR、PTGS2的結(jié)合能
圖6 木犀草素、β-胡蘿卜素、花生四烯酸分別與NCOA2、PGR、PTGS2的分子對(duì)接模式
3.2 三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘潛在作用靶點(diǎn) 本研究表明,核受體輔激活因子2(NCOA2)、PGR、PTGS2是三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘互作網(wǎng)絡(luò)中排名前3的靶點(diǎn),其中NCOA2、PTGS2為紫蘇子和芥子的共同靶點(diǎn)基因;NCOA2、PGR為紫蘇子和萊菔子的共同靶點(diǎn)基因。NCOA2為3味中藥的共同作用靶點(diǎn),PTGS2為木犀草素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素的共同作用靶點(diǎn)。說明三子養(yǎng)親湯中不同成分具有共同或相似的靶點(diǎn),這與中藥配伍的相使思想一致,這些靶點(diǎn)是三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)。NCOA2是p160甾體受體輔活化子(SRC)家族的一員,在許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用,包括發(fā)育、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生。PGR即為孕激素受體,臨床研究發(fā)現(xiàn)月經(jīng)期哮喘患者雌激素升高和孕激素降低可增強(qiáng)氣道高反應(yīng)性,可能是月經(jīng)期哮喘的原因[12]。孕激素和雌激素可以降低重癥哮喘患者let-7fmicroRNA的表達(dá)和增加IL-23/IL-23信號(hào)表達(dá)和IL-17A表達(dá),也可能是女性重癥哮喘患者多于男性的原因[13]。
前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS),又稱環(huán)加氧酶,有組成型PTGS1(又稱COX1)和誘導(dǎo)型PTGS2(又稱COX2)兩種同工酶,它們?cè)诒磉_(dá)和組織分布的調(diào)節(jié)上存在差異。COX-2參與花生四烯酸代謝成各種PGI產(chǎn)物,能誘發(fā)哮喘急性發(fā)作[14]。COX-2也能誘導(dǎo)分泌IL-18、前列腺素等炎癥介質(zhì),加重炎癥反應(yīng),誘發(fā)哮喘或使哮喘加重。炎性細(xì)胞因子、生長因子等均能誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)[15]。
3.3 三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的機(jī)制 哮喘與炎癥、細(xì)胞因子有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),木犀草素可通過抑制COX-2[16]的表達(dá)從而減少PGE2的生成;能顯著減輕活化的巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng),下調(diào)IL-6、IL-1β和TNF-α等致炎因子的表達(dá)。木犀草素能減少活性氧和活性氮的生成,抑制炎性細(xì)胞[17-18]因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá),從而緩解炎癥反應(yīng)。在哮喘的病理生理過程中,研究表明,PI3K通過影響炎癥細(xì)胞的募集、激活、凋亡及細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮著重要作用。在哮喘發(fā)生的炎癥過程中,T細(xì)胞扮演著重要作用,哮喘發(fā)病機(jī)制與Th1/Th2細(xì)胞在數(shù)量、活化及功能方面的比例失衡有密切的關(guān)系。研究推測(cè),PI3K信號(hào)通路通過參與Th1/Th2的失衡,而參與哮喘發(fā)病過程[19]。本研究結(jié)果顯示三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘涉及的最主要通路為PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway),這與文獻(xiàn)報(bào)到相一致。
3.4 分子對(duì)接 從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對(duì)接結(jié)果可知,與關(guān)鍵靶點(diǎn)NCOA2、PGR、PTGS2的親和力,三子養(yǎng)親湯中木犀草素、β-胡蘿卜素比臨床常用化學(xué)藥沙丁胺醇、氨茶堿的低,表明結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,結(jié)合活性較高,對(duì)于治療支氣管哮喘因該有較好的療效,可能是潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。
綜上,本研究發(fā)現(xiàn)三子養(yǎng)親湯中的核心活性成分木犀草素、β-胡蘿卜素作用于NCOA2、PGR、PTGS2等多個(gè)靶點(diǎn),調(diào)節(jié)PI3K-Akt等多條信號(hào)通路,從而發(fā)揮治療支氣管哮喘的作用,為進(jìn)一步研究三子養(yǎng)親湯藥理藥效機(jī)制提供了思路和科學(xué)依據(jù)。