★ 陳祥云 彭財英 潘玲玲 盧健 陳圣加 舒積成*

（江西中醫(yī)藥大學 南昌 30004）

南天竹（Nandina domestica），小檗科（Berberidaceae）南天竹屬（Nandina）小灌木，別名：南天竺，紅杷子，天燭子，紅枸子，鉆石黃，天竹，蘭竹等［1］。主要分布在湖北、江蘇、浙江、安徽、江西、山東、廣西、云南、四川等省，具有觀賞、生態(tài)、藥用等多種價值［2］。南天竹的次生代謝產物為生物堿、黃酮、揮發(fā)油類等，而生物堿成分為主要的活性成分，具有降壓，抗痙攣，抗菌，止咳平喘，解毒等作用［3］。文獻及本課題組研究發(fā)現(xiàn)，南天竹提取物對抗腫瘤藥三氧化二砷具有較好的減毒作用［4-5］。另外，本課題組前期研究結果顯示，南天竹總生物堿對三氧化二砷所致心毒具有明顯拮抗作用［6］。因此，有必要對南天竹總生物堿提取純化工藝進行優(yōu)化，為南天竹的進一步開發(fā)和利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2550 型紫外分光光度計；電子分析天平（北京塞多利斯儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（杭州庚雨儀器有限公司，HH-ZK2 型）；R501 旋轉蒸發(fā)器（杭州庚雨儀器有限公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MH-1000 型可調式電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（杭州庚雨儀器有限公司）；低溫冷卻液循環(huán)泵（杭州康雨儀器有限公司，DLSB-5/20 型）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司、太倉精宏儀器設備，DHG-9070A 型）。

1.2 試劑與試藥 南天竹購于江蘇蘇州，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學付小梅教授鑒定；鹽酸小檗堿對照品（北京賽百草科技有限公司，純度：≧98%，批號：633658）；D101、HPD-722、AB-8、NKA- Ⅱ、NKA-9、ADS-17 型大孔吸附樹脂、732 陽離子樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司）；溴甲酚綠（上海馨晟試化工科技有限公司，批號：20160908）；溴百里香酚藍（上海馨晟試化工科技有限公司，批號：20160602）；其它化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 南天竹中總生物堿提取條件研究

2.1.1 總生物堿的含量測定方法的確定 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品約12.8mg，置50mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL 至25mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成濃度為10.24μg·mL-1的鹽酸小檗堿對照品溶液。

酸性染料的配制 溴甲酚綠：稱取0.1g 溴甲酚綠粉末于研缽中，加入2.8mL 的NaOH，研磨至粉末充分溶解后，加入200mL 的蒸餾水稀釋，移入具塞的廣口瓶中備用。溴百里香酚藍：稱取0.1g 溴百里香酚藍粉末于研缽中，加入3.2mL 的NaOH，研磨至粉末充分溶解后，加入200mL 的蒸餾水稀釋，移入具塞的廣口瓶中備用。

酸性染料比色法 精密吸取一定量的供試品溶液，用pH=5.0 的磷酸二氫鉀緩沖液4mL 溶解，轉移至含有酸性染料3mL 的分液漏斗中，搖勻靜置30min，加入氯仿5mL，震搖靜置10min，取氯仿層，萃取兩次，合并。

測試波長確定 取1mL 對照品溶液分別用2種顯色劑，顯色后，經(jīng)5mL 氯仿分2 次萃取，氯仿定容至25mL，氯仿萃取液作為2 種測試液，以無水甲醇為空白對照，在200～600nm 進行全波長掃描，確定最大波長。結果表明：經(jīng)過顯色劑顯色后，兩者在417nm 處均具有穩(wěn)定吸收，因此選擇417nm為測試波長。

酸性染料的選擇 取2mL 對照品溶液，在測試波長處，分別測定溴甲酚綠、溴百里香酚藍2 種不同顯色劑吸光度的大小，結果顯示，在417nm 處，溴甲酚綠作為顯色劑測得吸光度值相對較大，因此確定最佳顯色劑為溴甲酚綠。

酸性染料用量的確定 取2mL 對照品溶液，分別置于不同的25mL 容量瓶中，加入配置好的顯色劑溶液1.0、1.5、2、2.5、3mL，分別加入pH=5.0 的磷酸二氫鉀緩沖液4mL 溶解，搖勻靜置30min，加入氯仿5mL，震搖靜置10min，取氯仿層，萃取兩次，合并，測試波長下測吸光度，結果如圖1 顯示，隨著酸性染料用量的增加，吸光度值逐漸遞增，為保證結果準確，優(yōu)選最佳用量為3mL。

圖1 酸性染料用量試驗數(shù)據(jù)

圖2 緩沖液pH值試驗數(shù)據(jù)

緩沖溶液pH 值 取2mL 對照品溶液，分別置于不同的25mL 容量瓶中，加入配置好的顯色劑溶液，分別加入pH=5.0，5.5，6.0，6.5，7.0 的磷酸二氫鉀緩沖液4mL 溶解，搖勻靜置30min，加入氯仿5mL，震搖靜置10min，取氯仿層，萃取兩次，合并，測試波長下測吸光度，結果如圖2 顯示，隨著PH 值的增加，吸光度值逐漸減小，由測定效果上來看，選出最佳pH 為5.0。

緩沖溶液用量的確定 取2mL 對照品溶液，分別置于不同的25mL 容量瓶中，加入配置好的顯色劑溶液，分別加入pH=5.0 的磷酸二氫鉀緩沖液2.5，3，3.5，4，4.5mL 溶解，搖勻靜置30min，加入氯仿5mL，震搖靜置10min，取氯仿層，萃取兩次，合并，測試波長下測吸光度，結果如圖3 顯示，緩沖劑用量的吸光度值差別不大，且數(shù)值均較大，推測樣品量過大影響了結果，但從細小的差距中，可以選出最佳pH 緩沖溶液用量為4.5mL。

圖3 緩沖液用量試驗數(shù)據(jù)

2.1.2 含量測定方法學考察 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5mL，按照最佳顯色方法測定，以甲醇作為對照，用紫外分光光度計在測試波長417nm 處測其吸光度，以對照品濃度（C）為橫坐標，吸光值A 值為縱坐標，進行線性回歸，結果見圖4。

圖4 線性關系

由圖4，得出標準曲線為Y=0.0161X-0.0279，r=0.9992，在10.24～51.20μg·mL-1范圍內鹽酸小檗堿的線性關系良好。

精密度試驗 精密吸取樣品溶液2mL，顯色后，測定吸光度。測定6 次。由試驗結果得出其精密度RSD=0.144%，證明儀器精密度良好。

重復性試驗 分別精密吸取樣品溶液2mL，制備6 份供試品溶液，顯色后測定吸光度。由數(shù)據(jù)RSD=2.66% 可得，其儀器重復性良好。

穩(wěn)定性試驗 精密吸取樣品溶液2mL，分別在0，20，40，60，80，100，120，160，180 min，顯色后測定其吸光度。結果顯示，在3 h 內，吸光度值的平均值為0.3934，RSD=0.246%，因此可視儀器的穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗 精密量取樣品溶液2mL，共6份，每份分別加入對照品溶液2.5mL，作為供試品溶液，顯色后測定吸光度。結果顯示，平均回收率96.38%，RSD=2.61%，其加樣回收試驗良好。

2.1.3 提取方法考察 本試驗研究考察超聲提取、回流提取和滲漉提取3 種方法對總生物堿提取得率的影響。

超聲提取法 稱取藥材細粉50.00g，量取12倍（600mL）75%乙醇，浸泡1h，在溫度31℃，超聲功率為100W 的條件下進行超聲提取，提取2 次，每次1h，將兩次超聲提取的提取液合并，減壓回收乙醇，在70℃水浴下濃縮的浸膏，將得到的浸膏放入真空干燥箱中干燥至恒重后，放冷后，進行稱重。制備供試品，顯色后測定吸光度。

回流提取法 稱取藥材細粉50.00g，量取12倍（600mL）75%乙醇，浸泡1h，進行回流提取2次，每次1h，兩次提取的提取液合并，減壓回收乙醇，在70℃水浴下濃縮的浸膏，將得到的浸膏放入真空干燥箱中干燥至恒重后，放冷后，進行稱重。制備供試品，顯色后測定吸光度。

滲漉提取法 稱取藥材粉末50.00g，量取適量75%乙醇，浸泡1d，進行充分的膨脹，將濕潤膨脹后的藥材，少量多次轉移至自制的滲漉筒內，加入600mL 75%乙醇浸漬24～48h，以0.6mL·min-1速度進行滲漉，不斷添加溶劑，保證溶劑高出藥材，收集滲漉液，減壓回收乙醇，在70℃水浴下濃縮的浸膏，將得到的浸膏放入真空干燥箱中干燥至恒重后，放冷后，進行稱重。制備供試品，顯色后測定吸光度。

供試品制備與測定 取提取物浸膏約0.20g，置100mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇液50mL，稱重，超聲處理30min，放冷，稱重，用甲醇液補足重量。過濾，精密量取續(xù)濾液1mL 于25mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。以甲醇液為空白對照，于417nm 波長處測定A 值，從標準曲線上，計算出供試品溶液中鹽酸小檗堿的濃度。結果表明對比3 種提取方法，滲濾提取藥材中的生物堿最純，但其提取的總量要小于回流提取，且時間最長，而超聲提取雖方法簡單易操作，但其提取的效率較其他兩者不高。從提取總量上來看，提取方法優(yōu)選回流提取法。見表1。

表1 考察試驗結果

2.1.4 最佳工藝確定 正交試驗設計 單因素試驗考察中得出醇濃度在65%時，提取時間為1.0h，提取3 次時，料液比為1∶10，總生物堿提取量最好，根據(jù)醇濃度、料液比、時間、提取次數(shù)對總生物堿得率的影響，按照L9（34）表進行試驗，各因素、水平見表2。

表2 正交表

正交試驗 稱取藥材，共9 份，各50.00g，采用上述優(yōu)先的最佳提取方法—回流提取，以提取物中總生物堿的含量為考察指標，優(yōu)選提取工藝。按因素水平表設計的條件進行回流提取，提取液濾過，濾液合并，測定生物堿及小檗堿的含量，計算提取率。結果顯示，在影響回流提取南天竹總生物堿的四個因素（醇濃度、提取時間、料液比、提取次數(shù)）中，根據(jù)極差值Ri 及方差分析，各因素對南天竹總生物堿提取率影響的主次順序為D＞C＞B＞A，即提取次數(shù)影響最大，其次為提取時間，可得出最佳的提取工藝為A2B1C2D3，即75%乙醇，1∶8 的料液比，提取3 次，每次1h。見表3。

表3 正交試驗結果

（續(xù)表）

2.1.5 驗證試驗 同一批藥材稱取3 份各50g，按照得到的最佳工藝條件提取，回收溶劑濃縮得浸膏，取浸膏0.2g 制備供試品，顯色后測定吸光度，計算總生物堿量，實驗平行3 次。如表4。結果，南天竹總生物堿的提取工藝穩(wěn)定，得率平均為2.53%。

表4 驗證試驗結果

2.2 南天竹總生物堿純化條件研究

2.2.1 樹脂的選擇及預處理 樹脂的預處理 大孔樹脂：用95%乙醇浸泡24h，充分溶脹，用乙醇洗至溶液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象時為止（取1mL 流出液加5mL 蒸餾水），最后用蒸餾水洗至無醇味，備用。陽離子樹脂：稱取適量陽離子樹脂，用去離子水浸泡2h，去離子水洗至無色顯中性，用2%HCl 沖洗至顯酸性，再用去離子水洗至顯中性，用2%NaOH 沖洗至顯堿性（pH=8～9），將顯堿性的陽離子樹脂用去離子水洗至顯中性，用2%HCl 沖洗至顯酸性，再用去離子水洗至顯中性，備用。

樹脂的篩選 為較大程度的模擬生產過程，聯(lián)系實際應用，本實驗采用靜態(tài)吸附以及動態(tài)吸附法選擇樹脂，分別用相同體積樹脂以及相同質量的樹脂進行比較。備選樹脂分別為大孔樹脂D101、ADS-17、NKA-9、NKA- Ⅱ、AB-8、HPD-722、陽離子樹脂732。

2.2.2 上樣溶液的制備 最佳提取工藝回流提取，匯總提取液，回收乙醇后，蒸干，去適量加水稀釋，制得濃度為8mg·mL-1的生藥液，備用。

2.2.3 靜態(tài)吸附 稱取不同型號大孔吸附樹脂1.0 （濕），置100mL 燒杯中，加樣品溶液20mL，每隔5min 振搖10s，持續(xù)2h，然后靜置24h，充分吸附后，濾過，測定吸附前后溶液的吸光度值，計算靜態(tài)吸附率。吸干經(jīng)靜態(tài)飽和吸附總生物堿后的各型號樹脂表面水分，精密加入95%乙醇25mL，每隔5min 振搖10s，持續(xù)2h，測定洗脫液中總生物堿的質量濃度，計算飽和吸附量和解吸率。結果顯示，ADS-17 的吸附率較低，D101、NKA-Ⅱ、AB-8、732 陽離子樹脂的解析率較其他前兩者低，從吸附率以及解析率來看，優(yōu)選NKA-9 與HPD-722 兩種進行動態(tài)實驗。見表5。

飽和吸附量=（原料液質量濃度×原料液體積-流出液質量濃度×流出液體積） /濕樹脂的量

吸附率=飽和吸附量/原料液中總堿的量× 100%

解吸率=洗脫液質量濃度×洗脫液體積/飽和吸附量×100%

表5 靜態(tài)吸附結果

表6 動態(tài)吸附結果

2.2.4 動態(tài)吸附實驗 準確稱取樹脂適量，經(jīng)預處理合格后濕法裝柱，準確吸取上樣液10mL，以流速0.5mL·min-1上柱，預吸附2h。先用9 倍蒸餾水以1.0mL·min-1流速洗脫，至洗脫液無色，再以80%乙醇0.5mL·min-1流速洗脫，洗脫至近無色，分別收集洗脫液，經(jīng)濃縮干燥后得干燥物，計算各洗脫部分的總生物堿含量。結果顯示：綜合靜態(tài)吸附實驗及動態(tài)實驗結果，HPD-722 比吸附量以及比洗脫量均略高于NKA-9，因此得出最佳樹脂類型為HPD-722。見表6。2.2.5 動態(tài)吸附因素考察 上樣液濃度考察 準確稱取處理好的樹脂3 份，每份樹脂30g（濕重），濃度分別為8mg·mL-1（10mL），4mg·mL-1（20mL），2mg·mL-1（40mL） 的上柱液各 1 份，以0.5mL·min-1流速動態(tài)上樣，然后用 6 倍蒸餾水以0.5mL·min-1流速洗脫，至洗脫液無色，再以 8 倍 80% 乙醇以0.5mL·min-1流速洗脫，至洗脫液無色，分別收集洗脫液。測定總生物堿含量，計算吸附率及洗脫率。結果顯示：對比三者得到生物堿的純度，得出濃度4mg·mL-1為最佳上樣液濃度。

最大上樣量 準確稱取處理好的樹脂30 g（濕重），取濃度為4mg·mL-1的上樣液，以0.5mL·min-1的流速加入樹脂中，用容器收集流出液，每10mL一管，測定收集液中的總生物堿的含量，繪制關于吸附的動態(tài)曲線。結果顯示，當上樣量的體積在20mL 左右的時候，生物堿類物質開始泄露增加，為減少損失，提高回收率，本實驗選用最大上樣量為35mL。結果見圖5。

圖5 動態(tài)吸附泄漏曲線

圖6 動態(tài)洗脫濃度曲線

醇濃度考察 取處理好的樹脂30g（濕重），制備樣品溶液，吸取樣品溶液20.0mL，以0.5mL·min-1流速動態(tài)上樣，上樣完畢后靜置2h。然后用6 倍蒸餾水以0.5mL·min-1流速洗脫，至水洗脫液無色；再依次用 8 倍的35%、50% 、65%、80%、90%乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液。測定洗脫液總生物堿含量，計算不同濃度乙醇的洗脫率。結果顯示，隨著醇濃度的增加，洗脫率增加，醇濃度80% 以上時增加減少，洗脫效果接近，成本考慮，選擇80%為最佳洗脫醇濃度。結果見圖6。

洗脫用水體積 取處理好的樹脂30g（濕重），吸取樣品溶液，以0.5mL·min-1流速動態(tài)上樣，靜置2h，分段收集滲出液，計算滲出液中的總生物堿含量。結果顯示，隨著洗脫水體積的增加，濃度逐漸降低，從節(jié)約方面考慮，當水洗脫體積達到6 倍的時候，洗脫完全。因此最佳洗脫體積為6 倍。結果見圖7。

圖7 動態(tài)洗脫用水體積曲線

圖8 動態(tài)洗脫醇體積曲線

醇洗脫量 取處理好的樹脂30g（濕重），吸取樣品溶液20.0mL，以0.5mL·min-1流速動態(tài)上樣，上樣后靜置2h。然后用6 倍蒸餾水以0.5mL·min-1流速洗脫，再用80%乙醇以0.5mL·min-1流速進行洗脫，分段收集滲出液，計算洗脫液中總生物堿的含量。結果表明，隨著體積的增加，濃度逐漸降低，對比總體及實驗時間的考慮，當醇洗脫體積達到10 倍時，洗脫完全，因此，最佳洗脫體積為10 倍，結果見圖8。

上樣流速 取質量濃度為4mg·mL-1的4 份上樣液20mL，緩緩加上，流速分別為0.5，1，2，3mL·min-1。上樣完成后，靜置2h，用6 倍蒸餾水洗脫，收集上樣流出液和水洗脫液。測定總生物堿含量，計算吸附率。結果表明，隨著流速的增大，吸附率開始下降，雖流速慢，吸附率大，但耗時較長，經(jīng)綜合考慮，選流速為2mL·min-1。

醇洗流速 按上述所確定的最優(yōu)條件上樣，先用6 倍水洗脫后，用 80% 乙醇 10 倍洗脫，流速分別為0.5，1，2mL·min-1，收集洗脫液。測定總生物堿含量。結果，隨著流速的增加，洗脫率逐漸降低，醇洗流速0.5mL·min-1與1mL·min-1的結果差距不大，綜合考慮時間及純度比較，最佳醇洗流速為1mL·min-1。

2.2.6 驗證試驗 取處理好的樹脂30g（濕重），按大孔樹脂預處理下，濕法裝柱并洗去雜質。制備樣品溶液，吸取樣品溶液15.0mL，以0.5mL·min-1流速動態(tài)上樣，上樣完畢后靜置 2 h。然后按照得到的最佳純化工藝進行純化，收集洗脫液，測定總生物堿含量。實驗平行3 次。如表7。結果，HPD722 大孔樹脂純化南天竹中總生物堿效果明顯，總生物堿可從提取液中15.02%含量提升到70%以上。

表7 純化驗證試驗結果

3 討論

目前，對南天竹總生物堿的含量測定方法未見報道，南天竹生物堿主要是小檗堿類和原小檗堿類衍生物。文獻檢索發(fā)現(xiàn)，與上述母核結構相類似的總生物堿含量測定的方法多采用酸性染料比色法［7-8］，該法主要針對生物堿類藥物，樣品用量少，靈敏度高，具有一定的專屬性和準確度［9］。故本實驗在文獻的基礎上，優(yōu)先出南天竹總生物堿含量測定具體工藝。運用此方法需按照嚴格步驟操作，盡量減少人為誤差。試驗中所配制的酸性染料不宜使用時間過長，為保證數(shù)據(jù)偏差，建議在1 周內使用。生物堿于酸性染料形成的絡合物易見光分解，注意避光。進行紫外測定時，濃度過大測量結果的誤差增大，因此濃度不易過大。

本實驗以小檗堿作為對照品，采用酸性染料比色，經(jīng)正交試驗得出，回流提取法為南天竹總生物堿的最佳提取方法，且最佳提取工藝為75%乙醇，1∶8 的料液比，提取3 次，每次1h。通過對影響大孔樹脂吸附及解吸的各種因素系統(tǒng)研究，證明HPD-722 型樹脂對于南天竹總生物堿具有吸附快、解吸較易、流體流動性能好、操作簡單和周期短等優(yōu)勢，因而有利于規(guī)模化生產。經(jīng)HPD-722 處理后的南天竹干浸膏中總生物堿的含量可達70% 以上。南天竹總生物堿含量明顯提高。結果可為南天竹總生物堿相關制劑工藝奠定了良好基礎，為大生產提供科學參考。

在進行樹脂靜態(tài)試驗篩選時，樹脂用量從節(jié)約樣品以及實驗時間上考慮，不易用量過多，建議與樣品量比為1∶20。為保證測量準確，樣品用量要高于樹脂的吸附量。不論靜態(tài)還是動態(tài)試驗，要保證樹脂有足夠的時間進行充分吸附，建議靜置24 h。隨著吸附洗脫次數(shù)的增加，樹脂內雜質增多，吸附力降低，考慮生產成本，保證總生物堿的回收率及純度，建議使用3～4 次后必須對樹脂進行再生處理。