霍朝晨，趙鐸，何水清，鐘萬錦，王建豪，晏磊，王偉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤有機(jī)物質(zhì)分解和養(yǎng)分釋放、能量轉(zhuǎn)移等生物地化循環(huán)中起著重要作用[1]。但是，土壤中有大量未培養(yǎng)微生物目前無法探知其功能，不依賴于純培養(yǎng)的現(xiàn)代分子生態(tài)學(xué)方法是研究土壤微生物多樣性和功能的有效方法。土壤微生物參與土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動(dòng)，促成土壤形成。同時(shí)，微生物自身還含有一定數(shù)量的C、N、P、S 等，可看成是一個(gè)有效養(yǎng)分的儲(chǔ)備庫，對土壤肥力的提高有重要作用[2]。鹽堿地由于土壤質(zhì)量差、作物產(chǎn)量低，在全球分布廣泛，已成為土壤退化中的世界性難題，土壤微生物可作為評價(jià)鹽堿地土壤質(zhì)量變化的一個(gè)重要指標(biāo)[3]。

黑龍江省是我國的產(chǎn)糧大省，水稻種植面積200多萬hm2。大慶市地處松嫩平原，地勢平緩，低洼易澇，土質(zhì)以黑鈣土、草甸土和沙壤土為主，非常適合水田生產(chǎn)，且水田灌區(qū)控制面積廣闊，適宜水田開發(fā)的土地資源較為豐富。近年來，隨著水稻的經(jīng)濟(jì)效益的提高，農(nóng)民把旱田改為水田，把低洼易澇的土地、鹽堿地變?yōu)榉侍?，水田所占比重大幅提高。而國?nèi)關(guān)于旱改水的研究在旱改水可行度、對生態(tài)環(huán)境影響和土壤微生物數(shù)量變化的分析方面較集中[4-8]，對于旱改水對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究鮮有報(bào)道。

為了解鹽堿土壤旱田改水田后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，研究采用16S rRNA 基因擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)對土壤細(xì)菌和古菌多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)合土壤理化性質(zhì)明確旱田改水田之后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化以及微生物群落與環(huán)境因子的關(guān)系，為鹽堿土旱改水提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

大慶市位于黑龍江省西南部，松嫩平原中部。該區(qū)屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫4.2 ℃，年降水427.5 mm。研究區(qū)域位于大慶市高新區(qū)（旱田：46°58′32″N，125°17′34″E；水田：46°58′39″N，125°17′36″E），土壤類型為鹽堿土，旱田種植品種為大豆，改水田后種植品種為水稻。

1.1 試驗(yàn)材料

選取旱田和改水田年限為3 年的地塊，旱田和水田均在秋收后進(jìn)行取樣，每種土壤取樣3 次，并將旱田和水田土壤樣品分別命名為h 和n。采用5 點(diǎn)取樣法，取0～20 cm 深度的旱田和水田土壤500 g，一部分樣品風(fēng)干，用于測定理化性狀，一部分放置于-80 ℃超低溫保存箱（中國HAIER DW-86L338J）保存，用于微生物分析。

1.3 理化指標(biāo)與測定方法

1.3.1 土壤pH 測定

土壤pH 值測定采用國標(biāo)法（NY-T 1377-2007）測定[9]。待測土壤經(jīng)室溫風(fēng)干后，研磨過2 mm 篩，稱取10 g 過篩后土壤，按水土比5∶1 比例加水，攪拌5 min 后，室溫靜置1～3 h，用微型pH 計(jì)（日本HORIBA）測定土壤pH 值。

1.3.2 土壤水溶性鹽含量測定

土壤水溶性鹽含量采用殘?jiān)娓煞ǎ∟Y/T 1121.16-2006）進(jìn)行測定[10]。待測土壤經(jīng)室溫風(fēng)干后，研磨過2 mm 篩，稱取50 g 過篩后土壤，按水土比5∶1比例加水，振蕩3 min 后，過濾，用移液管吸取100 mL浸出液，注入已干燥、稱重的燒杯，放于105 ℃烘箱烘干，當(dāng)殘?jiān)霈F(xiàn)黃褐色時(shí)，應(yīng)加15%雙氧水1～2 mL，繼續(xù)烘干，直至黃褐色消失。計(jì)算公式：含鹽量（%）=（m杯+鹽-m杯）/m樣*100。

1.3.3 土壤有機(jī)質(zhì)含量測定

土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化法（NY-T 1377-2007）進(jìn)行測定[9]。待測土壤經(jīng)室溫風(fēng)干后，研磨過2 mm 篩，稱取0.1 g 過篩后土壤，分別添加5 mL 濃硫酸（98%，化學(xué)純）和5 mL 重鉻酸鉀（0.8 mol·L-1），置于170 ℃～180 ℃磷酸浴中沸騰計(jì)時(shí)5 min，冷卻后滴2～3 滴鄰菲羅林指示劑，使用0.2 mol·L-1硫酸亞鐵進(jìn)行滴定。

1.3.4 土壤全氮、有效磷、速效鉀含量測定

土壤全氮含量采用半微量凱氏法（NY/T 53-1987）進(jìn)行測定[11]；土壤速效鉀含量采用中性乙酸銨溶液浸提、火焰光度計(jì)法（NY/T 889-2004）測定[12]；土壤有效磷含量采用碳酸氫鈉法（LY/T 1233-1999）測定[13]。

1.4 微生物多樣性分析

1.4.1 土壤總DNA 的提取

采用改良的氯苯法進(jìn)行總DNA 提取[14]，所提取總DNA 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整程度，其中電泳電壓為120 V，時(shí)間15 min，同時(shí)采用超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Nanodrop 2000c）對其濃度進(jìn)行測定，選取DNA 總量超過500 ng 和OD260/280 在1.8～2.0 之間以及瓊脂糖凝膠電泳主帶清晰的DNA 樣品。

1.4.2 引物的選取、擴(kuò)增條件和測序

針對16S rRNA gene V4 區(qū)作為特異性擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，細(xì)菌16S V4 區(qū)引物為515F（5′-GTGCCAGCM GCCGCGGTAA-3′）和909R（5′-CCCCGYCAATTCMT TTRAGT-3′）[14]，古菌引物為344F（5'-ACGGGGYGC AGCAGGCGCGA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′）[15]。擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）為PCR supermix 10 μL，正向引物（10 μM）1 μL，反向引物（10 μm）1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃最終延伸5 min，28個(gè)循環(huán)。

1.4.3 測序數(shù)據(jù)處理

利用Qiime（version 1.9.0）對原始序列進(jìn)行過濾處理，得到所有優(yōu)質(zhì)序列，隨后利用Usearch（version 8.0）去除所得嵌合體，獲得有效序列。利用Qiime 中cd-hit 方法對所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，以97%相似度為閾值將序列聚類成OTU，同時(shí)選取OTU 的代表序列，并去除其中的singleton（所有樣品中只有一條序列的OTU）。利用Qiime 軟件對OTU 代表序列進(jìn)行物種注釋，使用Greengenes 作為參考數(shù)據(jù)庫。利用Qiime 對ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Simposn 指數(shù)和Shannon 指數(shù)進(jìn)行Alpha 多樣性分析。根據(jù)OTU 表生成加權(quán)的Unifrac 距離矩陣，繪制PCoA 主坐標(biāo)分析圖進(jìn)行Beta 多樣性分析。結(jié)合土壤理化性質(zhì)測定結(jié)果，利用Canoco 5.0 軟件繪制RDA 冗余分析圖。利用Origin 2017 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿土壤旱田改水田后對土壤理化性質(zhì)的影響

土壤理化性質(zhì)是影響土壤微生物活性、多樣性及群落結(jié)構(gòu)的主要因素。由表1 可以看出，鹽堿土旱田改水田后，土壤的pH 和有效磷含量顯著升高（P=0.05），而對土壤的水溶性鹽、有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀含量沒有顯著影響。

表1 鹽堿土旱田和水田的土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil in saline-alkali soil dryland and paddy field

2.2 鹽堿土旱田改水田后對土壤細(xì)菌和古菌多樣性的影響

2.2.1 Alpha/Beta 多樣性分析

Chao1 指數(shù)是反映物種豐富度的指標(biāo)，指數(shù)越大代表菌群豐富度越高；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)是反映代表菌群多樣性的指標(biāo)，指數(shù)越高代表菌群多樣性越高。旱田細(xì)菌的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)高于水田（表2），而水田古菌的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)高于旱田（表3），說明鹽堿地旱田改水田后，細(xì)菌的豐富度和多樣性降低，而古菌的豐富度和多樣性升高。

表2 鹽堿土壤旱田和水田細(xì)菌的Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of bacteria in arid and paddy fields in saline-alkali soils

圖1 為土壤樣品細(xì)菌基于加權(quán)Unifrac 距離的PCoA 圖，圖2 為土壤樣品古菌基于加權(quán)Unifrac 距離的PCoA 圖，由圖中可以看出，兩組土壤樣品間距離較大，說明旱田改水田后，土壤在細(xì)菌和古菌的物種組成、物種豐度上有著明顯的差異。

表3 鹽堿土壤旱田和水田古菌的Alpha 多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of ancient bacteria in arid and paddy fields in saline-alkali soils

圖1 PCoA 主坐標(biāo)分析（細(xì)菌）Fig.1 PCoA main coordinate analysis（bacteria）

圖2 PCoA 主坐標(biāo)分析（古菌）Fig.2 PCoA main coordinate analysis（archaea）

2.2.2 細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)高通量測序結(jié)果，門的分類水平上旱田和水田分別檢測到31 和41 個(gè)細(xì)菌門，其中，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢細(xì)菌門（圖3），這9 個(gè)細(xì)菌門相對豐度之和在兩種樣本中占比均在93%以上。通過差異性分析（P=0.05）發(fā)現(xiàn)，旱田改水田后，變形菌門、綠彎菌門、放線菌門的相對豐度顯著升高，而芽單胞菌門、酸桿菌門、浮霉菌門的相對豐度顯著降低。

圖3 鹽堿土壤旱田（h）和水田（n）土壤樣品中門水平細(xì)菌分類注釋Fig.3 Taxonomic notes on phylum level of bacteria in saline-alkali soils dry field samples（h）and paddy field samples（n）

屬的分類水平上旱田和水田分別檢測到375 和498 個(gè)細(xì)菌屬，其中，梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、貪噬菌屬（Variovorax）、Flavisolibacter、Pontibacter 為優(yōu)勢細(xì)菌屬（圖4）。通過差異性分析（P=0.05）發(fā)現(xiàn)，旱田改水田后，硫桿菌屬、貪噬菌屬、不動(dòng)桿菌屬的相對豐度顯著升高，而梭狀芽孢桿菌屬、Flavisolibacter、Pontibacter 的相對豐度顯著降低。

圖4 鹽堿土壤旱田（h）和水田（n）土壤樣品中屬水平細(xì)菌分類注釋Fig.4 Taxonomic notes on generic level bacteria in saline-alkali soils dry field samples（h）and paddy field samples（n）

2.2.3 古菌群落組成分析

門的分類水平上旱田和水田分別檢測到26 和32 個(gè)古菌門，其中，泉古菌門（Crenarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeota）、微古菌門（Parvarchaeota）為優(yōu)勢古菌門（圖5），這3 個(gè)古菌門相對豐度之和在兩種樣本中占比均在70%以上。通過差異性分析（P=0.05）發(fā)現(xiàn)，旱田改水田后，微古菌門的相對豐度顯著升高，而泉古菌門、廣古菌門的相對豐度顯著降低。

屬的分類水平上旱田和水田分別檢測到251 和320 個(gè)古菌屬，其中，甲烷螺菌屬（Methanospirillum）、甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）、Candidatus Nitrososphaera、Candidatus Methanoregula、Methanocella 為優(yōu)勢古菌屬（圖6）。通過差異性分析（P=0.05）發(fā)現(xiàn)，旱田改水田后，甲烷螺菌屬、甲烷鬃菌屬、Candidatus Methanoregula、Methanocella 的相對豐度顯著升高，而Candidatus Nitrososphaera 的相對豐度顯著降低。

圖5 鹽堿土壤旱田（h）和水田（n）樣品中門水平古菌分類注釋Fig.5 Taxonomic notes on phylum level archaea in saline-alkali soils dry field samples（h）and paddy field samples（n）

圖6 鹽堿土壤旱田（h）和水田（n）樣品中屬水平古菌分類注釋Fig.6 Taxonomic notes on generic level archaea in saline-alkali soils dry field samples（h）and paddy field samples（n）

2.3 旱田和水田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的關(guān)系

2.3.1 細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

圖7 為針對旱田和水田土壤樣品中細(xì)菌多樣性和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析獲得的的RDA 排序圖。圖中箭頭所指方向代表了該環(huán)境因子的變化趨勢；線段的長短代表了環(huán)境因子對菌群結(jié)構(gòu)變化的影響；箭頭與排序軸間的夾角代表著該環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性，相關(guān)性越大夾角越小。

由圖7 所示，土壤樣品中優(yōu)勢菌群厚壁菌門（Firmicutes）位于第一象限，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、放線菌門（Actinobacteria）位于第二象限，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）位于第三象限，酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）位于第四象限。pH、有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效鉀集中于一二象限，水溶性鹽、全氮集中于三四象限。由此分析可知，變形菌門、綠彎菌門、硝化螺旋菌門、放線菌門與有效磷、速效鉀、pH、有機(jī)質(zhì)成正相關(guān)；芽單胞菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、浮霉菌門與水溶性鹽、全氮成正相關(guān)。環(huán)境因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響從大到小依次為pH、水溶性鹽、有效磷、速效鉀、全氮、有機(jī)質(zhì)。

圖7 鹽堿土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子RDA 圖Fig.7 RDA Map of saline-alkali soil bacterial community and environmental factors

2.3.2 古菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

圖8 為針對土壤樣品中古菌多樣性和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析獲得的的RDA 排序圖。由圖所示，土壤樣品中優(yōu)勢菌群Candidatus Methanoregula位于第一象限，Candidatus Nitrososphaera 位于第三象限，甲烷螺菌屬（Methanospirillum）、甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）、Methanocella 位于第四象限。有效磷、水溶性鹽集中于一二象限，速效鉀、pH、有機(jī)質(zhì)、全氮集中于三四象限。由此分析可知，Candidatus Methanoregula 與有效磷、水溶性鹽成正相關(guān)；Candidatus Nitrososphaera、甲烷螺菌屬、甲烷鬃菌屬、Methanocella 與速效鉀、pH、有機(jī)質(zhì)、全氮成正相關(guān)。環(huán)境因子對古菌群落結(jié)構(gòu)的影響從大到小依次為全氮、pH、有效磷、水溶性鹽、速效鉀、有機(jī)質(zhì)。

圖8 鹽堿土壤古菌群落與環(huán)境因子RDA 圖Fig.8 RDA Map of saline-alkali soil archaea community and environmental factors

3 討論

土壤pH 是衡量土壤酸堿度、反映土壤質(zhì)量的重要化學(xué)性質(zhì)之一，影響著土壤的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及土壤微生物的活性，進(jìn)而影響土壤肥力[16]，土壤pH 的改變將直接或間接地影響營養(yǎng)物的可利用性[17-18]。土壤有效磷水平是影響作物產(chǎn)量、評價(jià)土壤肥力以及環(huán)境污染程度的重要指標(biāo)之一[19]。研究表明，旱田改為水田后，pH 和有效磷含量顯著上升。pH 上升原因可能是含水量變化影響了離子在固相液相之間的分配和土壤中鹽類的溶解與解離，從而改變了土壤的pH[20]，或者植物殘留物在微生物的分解作用下給土壤補(bǔ)充大量的鹽基陽離子，增加了土壤的pH[21-22]。研究表明，淹水使土壤Ca2-P 型磷酸鹽和Ca8-P 型磷酸鹽含量提高，二者都是土壤中有效磷的重要組成部分[23]，同時(shí)在水稻種植中磷肥的施加，也可能是導(dǎo)致水田中有效磷含量上升的原因。

土壤微生物是土壤的重要組成部分，也是土壤和養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化的動(dòng)力[24]，能夠及時(shí)準(zhǔn)確地反映土壤養(yǎng)分狀況，對土壤中養(yǎng)分供應(yīng)起著極重要的作用[25]。研究中，鹽堿土旱田改為水田后，細(xì)菌群落多樣性降低，古菌群落多樣性升高。這可能是由于淹水形成厭氧環(huán)境，加之pH 上升，改變了土壤的氧化還原電位，各種生物酶活性也隨之改變，從而抑制了土壤中某些好氧微生物的生長。在微生物群落分析中我們發(fā)現(xiàn)，在門水平上，旱田的主要優(yōu)勢細(xì)菌為變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門，與杜澄鑫等的鹽堿土根際微生物群落研究結(jié)果類似[26]；水田的主要優(yōu)勢細(xì)菌為變形菌門，其相對豐度為40.05%，與李新的河套灌區(qū)的鹽堿土研究結(jié)果一致[27]。旱田改水田后，變化最大的為變形菌門和酸桿菌門，變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，大多數(shù)變形菌門細(xì)菌營兼性或者專性厭氧生活，因此其相對豐度顯著上升，酸桿菌門中的細(xì)菌為嗜酸菌，隨著改水田后土壤堿性的增強(qiáng)，其相對豐度顯著下降。在屬水平上，旱田改水田后，甲烷螺菌屬、甲烷鬃菌屬、Candidatus Methanoregula、Metha-nocella 的相對豐度顯著升高，其中甲烷螺菌屬、甲烷鬃菌屬、和Methanocella 均為產(chǎn)甲烷古菌[28]，而已有研究發(fā)現(xiàn)在稻田和陸地淡水沉積物中，產(chǎn)甲烷菌的相對豐度較高[29-31]；不動(dòng)桿菌屬、硫桿菌屬的相對豐度顯著升高，不動(dòng)桿菌屬主要存在于土壤和廢水中[32]，它有助于磷酸鹽的累積[33]，同時(shí)，Miransari 觀察到硫桿菌屬可以增加磷的有效性[34]，這也可能是導(dǎo)致水田中有效磷含量上升的原因。

4 結(jié)論

（1）鹽堿土旱田改水田使土壤pH 和有效磷含量顯著升高。

（2）鹽堿土旱田改水田后，土壤中細(xì)菌群落的多樣性和豐富度降低，古菌群落的多樣性和豐富度升高，其中變形菌門和泉古菌門為主要的優(yōu)勢菌門，貪噬菌屬和Methanocella 為主要的優(yōu)勢菌屬。

（3）在旱田改水田過程中，pH 是對微生物群落結(jié)構(gòu)影響作用最大的環(huán)境因素，全氮含量對古菌群落結(jié)構(gòu)變化相關(guān)性最大。