鐘景斌,劉文彬,王暉

(1.廣東藥科大學中藥學院； 2.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

磷酸氯喹是臨床上最常用的抗瘧藥物，由于其免疫調(diào)節(jié)特性，在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病上已被廣泛使用[1]。研究已顯示氯喹具有廣譜抗病毒活性[2]，在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》中首次將磷酸氯喹納入抗病毒治療藥物[3]，因此，其對新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的治療效果與開展臨床試驗情況備受關(guān)注。氯喹在瘧疾治療研究中有大量報道，但其治療病毒性感染疾病研究較少，為此，本文主要從氯喹的抗病毒潛在作用機制、抗病毒研究狀況、氯喹及衍生物在新型冠狀病毒肺炎臨床試驗情況進行概述，強調(diào)需重視其在抗病毒治療時的不良反應，為更好地了解其廣譜抗病毒特點及臨床上安全、合理應用氯喹及其衍生物治療COVID-19提供參考。

1 氯喹抗病毒的潛在機制

氯喹可以通過干擾與細胞表面受體結(jié)合的病毒顆粒，阻礙受體與病毒的接觸，抑制病毒早期的入侵。在抑制SARS-CoV研究中顯示，氯喹可影響宿主細胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)，致糖基化缺陷而干擾病毒生長繁殖。另一方面，氯喹顯弱堿性，通過升高體內(nèi)的pH值干擾病毒以胞吞作用形成內(nèi)吞體入侵細胞，破壞病毒進入細胞內(nèi)復制所需的酸性水解酶，消除病毒膜與內(nèi)體膜融合，防止病毒顆粒脫殼，阻斷病毒的復制周期。由于病毒蛋白酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的翻譯后修飾發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或反式高爾基體的囊泡內(nèi)，氯喹可通過提高pH值干擾病毒蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。抗HIV作用的研究顯示，氯喹可通過某種方式促使病毒gp120片段變異，導致糖基化位點缺失而改變構(gòu)象，干擾gp120糖基化，減弱了病毒對靶細胞的感染力。除此之外，氯喹對免疫系統(tǒng)的影響被認為是抗病毒作用機制之一，在淋巴細胞和巨噬細胞中的聚集使其具有抗炎特性，通過減少促炎細胞因子的分泌，降低受體介導的腫瘤壞死因子α(TNF-α)信號傳導，調(diào)節(jié)免疫細胞，減少病毒感染時炎癥因子產(chǎn)生而起到抗病毒作用[4-5]

2 氯喹的抗病毒作用

2.1 抗冠狀病毒

冠狀病毒是一種嚴重影響人類和動物健康的病原體，主要導致腸道或呼吸道疾病。2003年的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、2012年的中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)、2019年的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)均為帶有包膜的正鏈RNAβ屬冠狀病毒，可導致人類嚴重呼吸系統(tǒng)及全身癥狀疾病的發(fā)生[6]。氯喹的抗冠狀病毒作用已有不少報道。

2.1.1 抗SARS-CoV

氯喹有效抑制SARS-CoV體外復制。Keyaerts等[7]證實氯喹對SARS-CoV感染非洲綠猴腎細胞(Vero E6細胞)有抗病毒作用，結(jié)果顯示半抑制濃度IC50為(8.8±1.2) μmol/L，顯著低于半數(shù)細胞毒性濃度CC50(261.3±14.5) μmol/L，進一步發(fā)現(xiàn)其在體外抑制SARS-CoV的IC50接近治療急性瘧疾時的血藥濃度，提示其可以預防和治療SARS-CoV感染，并提出氯喹可能調(diào)節(jié)SARS-CoV感染所致炎癥反應的假設。Vincent等[5]在感染SARS-CoV的Vero E6細胞的前后階段添加不同濃度氯喹，結(jié)果顯示氯喹均能抑制病毒的復制與傳播，具有顯著的劑量依賴性，進一步研究發(fā)現(xiàn)可能與干擾細胞受體ACE2的末端糖基化有關(guān)。雖然，氯喹在體外抗SARS-CoV研究的數(shù)據(jù)為臨床治療提供可能性，但仍需在動物模型以及臨床試驗研究中驗證療效。

2.1.2 抗MERS-CoV

2012年6月，MERS-CoV在沙特阿拉伯首次發(fā)現(xiàn)[8]，研究人員試圖從廣譜冠狀病毒抑制劑中尋找能夠抑制MERS-CoV復制的藥物。Wilde等[9]發(fā)現(xiàn)氯喹在半最大效應濃度EC50為(3.0±1.1) μmol/L濃度下抑制MERS-CoV感染人肝癌細胞(Huh7)的體外復制，且呈劑量依賴性。因MERS-CoV感染時與巨噬細胞(MDMs)和樹突狀細胞(MDDCs)間存在聯(lián)系，Yu等[10]在MDMs和MDDCs中評估了氯喹抗MERS-CoV活性，結(jié)果顯示其在這些原代細胞中沒有活性，并強調(diào)了在原代細胞中評價藥物的重要性?？筂ERS-CoV的研究集中在體外實驗，對于動物模型體內(nèi)研究較少，有必要作進一步的研究。

2.1.3 抗SARS-CoV-2

武漢病毒所團隊的Wang等[11]率先發(fā)表關(guān)于氯喹在體外試驗中有效阻斷SARS-CoV-2感染Vero E6細胞中病毒復制的研究。數(shù)據(jù)表明氯喹在EC50為1.13 μmol/L時即可有效抑制SARS-CoV-2感染，且抗病毒EC90值與用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎的血漿濃度接近，提示有可能對新冠肺炎起效。臨床試驗初步顯示，使用磷酸氯喹治療COVID-19患者8 d內(nèi)咽拭子核酸陰轉(zhuǎn)率高達80%(8例/10例)，顯著優(yōu)于使用洛匹那韋/利托那(20%，3例/15例)[12]。相對于陳軍等[13]利用硫酸羥氯喹治療30例普通型COVID-19患者初步研究表明，標準劑量的硫酸羥氯喹(400 mg，1次/d)治療并未顯示出有改善患者癥狀、加速病毒抑制等方面的臨床效果，但注意到以病毒轉(zhuǎn)陰率、重癥化率為主要終點的研究難以對藥物的療效進行比較，還需充分考慮樣本量等可行性問題。另據(jù)Gao[14]報道已有100多名新冠肺炎患者的臨床試驗結(jié)果表明，磷酸氯喹在抑制肺部炎癥的惡化、改善肺部影像學表現(xiàn)、縮短病程等方面好于對照治療，且上述患者服藥之后尚無嚴重不良反應的發(fā)生。上述研究進一步明確了氯喹對COVID-19臨床治療的有效性。

2.2 抗HIV

氯喹對抗HIV的研究集中在體外實驗及患者體內(nèi)。Savarino等[15]報道氯喹通過影響病毒包膜糖蛋白的產(chǎn)生抑制HIV-1和HIV-2的復制，影響gp120的末端糖基化以及干擾2G12抗體表位形成使氯喹具有廣譜抗HIV活性。一項臨床試驗表明[16]，慢性HIV感染者在治療期間服用氯喹，CD8T細胞以及CD8和CD4 T細胞中Ki-67的表達顯著降低，顯示其可降低全身性T細胞免疫活性，抑制HIV感染所引起的持續(xù)性免疫活化，揭示氯喹干預相關(guān)的HIV疾病發(fā)病機理。由于慢性免疫激活與HIV-1發(fā)病機制存在相關(guān)性，Martinson等[17]發(fā)現(xiàn)氯喹抑制HIV-1通過Toll樣受體7(TLR 7)誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)分泌干擾素α(IFN-α)，降低IFN-α介導的免疫激活并改善T細胞存活，顯示氯喹通過免疫調(diào)節(jié)作用干擾艾滋病毒在免疫激活方面的發(fā)病機制。除此之外，對氯喹聯(lián)合4種抗HIV藥物在體外考察抗HIV-1活性研究[18]，顯示聯(lián)用可以協(xié)同、相加或拮抗的方式抑制HIV-1活性，為聯(lián)合抗HIV藥物治療艾滋病提供了參考。

2.3 抗ZIKV

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是通過蚊子和蜱傳播給人類，屬于黃病毒科黃病毒屬的RNA病毒，每年造成數(shù)百萬次感染[19]。ZIKV感染后主要損害人類神經(jīng)前體，導致感染后孕婦中胎兒出現(xiàn)小頭畸形的可能性增大，但對其發(fā)病機制尚不明確。Li等[20]在體外篩選出氯喹顯著抑制ZIKV感染，并在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)氯喹保護胚胎中小鼠免受ZIKV感染及降低相關(guān)的小頭畸形出現(xiàn)。進一步研究顯示可降低細胞凋亡指示物半胱天冬酶3的激活，進而減少胎兒大腦中細胞凋亡效應。Shiryaev等[21]研究表明氯喹可能以升高內(nèi)體的pH值機制阻礙ZIKV通過內(nèi)吞作用和酸性內(nèi)體中的膜融合感染細胞，進而抑制ZIKV感染和人類神經(jīng)球細胞凋亡，降低急性ZIKV誘發(fā)的干擾素信號缺陷AG129小鼠的死亡率，抑制SJL小鼠ZIKV的感染，減少母嬰垂直傳播，表明氯喹可用于ZIKV的治療和預防。

2.4 抗DENV

登革熱病毒(Dengue virus，DENV)由埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介傳播的急性傳染病。體外實驗中顯示氯喹在Vero細胞培養(yǎng)物中干擾2型登革熱病毒的復制，表明其可能通過引起體內(nèi)pH的升高，破壞了病毒包膜和內(nèi)體膜融合，抑制了病毒的復制過程[22]。一項129名患者進行了氯喹抗登革熱的隨機、雙盲實驗[23]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可降低患者疼痛癥狀以及改善日常活動能力(P<0.05)，但沒有縮短疾病的持續(xù)時間或減弱發(fā)熱的強度。一項食蟹猴感染2型登革熱病毒研究[24]顯示與對照組相比，氯喹治療后動物病毒血癥的時間明顯減少，其中血清中腫瘤壞死因子α和干擾素γ的濃度顯著降低，表明其可能通過抗炎作用干擾動物體內(nèi)登革熱病毒2型的復制。這些為氯喹防治登革熱疾病提供了潛在的治療方案。

2.5 抗CHIKV

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是通過節(jié)肢動物傳播的病毒，該病典型的特征是在急性感染期內(nèi)，通常以發(fā)熱、肌肉疼痛和關(guān)節(jié)痛為特征。Khan等[25]研究了氯喹對Vero細胞中CHIKV復制情況，發(fā)現(xiàn)抑制病毒機制可能是防止內(nèi)吞作用或內(nèi)體酸化抑制CHIKV早期的復制，并以劑量依賴的方式減少了CHIKV感染。Chopra等[26]報道以70名CHIKV感染患者為研究對象，觀察氯喹對急性CHIKV感染后治療早期肌肉疼痛、骨骼疼痛和關(guān)節(jié)炎的優(yōu)勢，結(jié)果顯示氯喹與美洛昔康對患者癥狀有改善，但與對照組無療效差異，而氯喹治療組顯示炎癥細胞因子白介素6(IL-6)、白介素13(IL-13)水平明顯升高，需要進一步明確機制。以食蟹猴為研究對象，顯示氯喹使患急性基孔肯雅病的食蟹猴血液中病毒清除速度減慢，病毒載量升高，加重CHIKV感染[27]；另一項對54名CHIKV感染患者臨床研究顯示氯喹沒有改善患者臨床癥狀，隨時間推移,大部分患者經(jīng)歷關(guān)節(jié)疼痛，顯示氯喹對治療CHIKV患者無明顯療效，反而提示用藥時間過長會增加不良反應的風險。

2.6 抗人禽流感病毒

Yan等[28]報道氯喹抑制甲型H5N1禽流感病毒感染人肺癌A549細胞的死亡，并以劑量依賴的方式提高細胞的生存力。在甲型H5N1禽流感病毒誘導小鼠模型中觀察到，治療組的浸潤性白細胞較少，肺水腫顯著降低，表明氯喹作為自噬抑制劑可有效地改善急性肺損傷，提高存活率。在此之前，有研究顯示[29]H5N1通過一條涉及激酶Akt、腫瘤抑制蛋白TSC2和哺乳動物雷帕霉素靶點的通路誘導肺泡上皮細胞自噬細胞死亡，提示氯喹作為自噬阻滯劑可能對人類感染H5N1病毒有一定的預防和治療作用。

2.7 抗其他病毒

Vigerust等[30]在體外驗證了氯喹對流感病毒有抑制活性，但在動物模型中沒有顯示出預防或改善流感癥狀的有效性。有研究顯示[31]氯喹在體外抑制埃博拉病毒(EBOV)復制，而在豚鼠模型中未能顯示有效預防EBOV的感染。貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV)由貓冠狀病毒(feline coronavirus，F(xiàn)CoV)引起的致命疾病，Takano[32]研究證明氯喹在體外具有抑制FIPV復制和抗炎作用，在誘導患FIPV貓的模型研究顯示氯喹治療效果優(yōu)于對照組，表明氯喹對貓傳染性腹膜炎(FIP)有治療作用。手足口病是最常見的腸道病毒(Enterovirus)相關(guān)疾病之一，好發(fā)于幼兒和免疫功能低下的成人，Tan[33]研究氯喹對幾種血清型腸道病毒(腸道病毒A型和B型)具有抗病毒活性，在動物模型中顯示其提高感染腸道病毒71型(enterosvirus71,EV71)小鼠的存活率。勐臘病毒(Mengla virus,MLAV)是具有蝙蝠-人跨種傳播危害的絲狀病毒。陳勍等[34]建立囊膜表面糖蛋白(glycoprotein,GP)介導MLAV進入細胞模型，證實氯喹可有效阻斷MLAV進入宿主細胞的能力，降低埃博拉病毒(EBOV)感染小鼠死亡率。這些研究顯示氯喹的廣譜抗病毒性，但具體作用機制仍需深入研究發(fā)現(xiàn)。

3 氯喹及其衍生物在COVID-19臨床試驗研究情況

在中國臨床試驗注冊中心的新型冠狀病毒肺炎臨床研究索引中篩選出關(guān)于氯喹及其衍生物的臨床試驗情況，包含了磷酸氯喹、羥氯喹(硫酸羥氯喹與磷酸氯喹對比治療研究)。按照研究設計分為非隨機對照、隨機平行對照、單臂設計、雙盲隨機平行對照、單盲隨機對照。臨床試驗收治患者分為輕癥和普通型、輕中度、重癥及危重癥COVID-19患者。在給藥途徑方面，多數(shù)以口服方式，極少數(shù)以霧化吸入溶液進行探索性臨床試驗研究。但從目前的情況來看，磷酸氯喹開展COVID-19臨床研究比較多，且臨床數(shù)據(jù)初步顯示磷酸氯喹的療效與安全性。相反，羥氯喹的療效評價則需要更多臨床數(shù)據(jù)進一步驗證治療效果以及需密切關(guān)注其用藥后不良反應的發(fā)生。

4 不良反應

氯喹由于治療疾病范圍的不斷擴大，其不良反應報道隨之增多。主要的不良反應有：(1)消化系統(tǒng)。比較常見，以食欲減退、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉為主。(2)神經(jīng)肌肉方面。表現(xiàn)多為肌無力、麻木、肌肉萎縮。(3)廣泛的神經(jīng)精神癥狀。如頭暈、頭痛、失眠、譫妄、焦慮、抑郁、情緒障礙等反應。(4)變態(tài)反應。主要集中在皮膚上，如皮疹、光敏性皮炎、色素沉著、銀屑病加重、瘙癢等。(5)心臟毒性?？梢种聘]房結(jié)，延長QT間期、導致心律失常、心力衰竭、低血壓等癥狀。因此，用藥前需要了解患者是否患有心臟基礎性疾病等病史，用藥前需做好心電圖檢查。(6)長期使用會引起眼部毒性反應。由于氯喹在角膜上被吸收，導致角膜沉積與視網(wǎng)膜病變，嚴重影響視力，多與用藥劑量有關(guān)。使用時應進行眼科檢查。(7)血液系統(tǒng)影響。罕見再生障礙性貧血、各類血細胞減少癥、粒細胞缺乏癥和溶血性貧血等。

氯喹作為在臨床上應用多年的老藥，其安全性與療效已得到了良好的驗證。然而，對COVID-19的治療需要根據(jù)患者實際情況如患者過敏史、過往用藥情況、病情發(fā)展階段來制定安全的用藥方案，對于存在慢性疾病尤其在服藥時間較長的情況下應做好不良反應監(jiān)測，注意患者的眼科視力、心臟等異常癥狀，若發(fā)生嚴重不良反應時應及時停藥處理，以免加重病情惡化。大多數(shù)的不良反應在停藥后癥狀可減輕、改善。劉華靜等[35]最近報道3例COVID-19患者口服氯喹500 mg，2次/d后均出現(xiàn)心悸、心電圖異?，F(xiàn)象，在停用氯喹后，不良反應癥狀消失。值得關(guān)注的是，國家衛(wèi)生健康委[36]下發(fā)了《關(guān)于調(diào)整試用磷酸氯喹治療新冠肺炎用法用量的通知》的文件，明確了磷酸氯喹在新型冠狀病毒肺炎治療中的適用人群和具體的用法用量，對禁忌癥和相對禁忌癥及注意事項作了詳細的指導，確保該藥在臨床使用中更加安全有效合理。

5 小結(jié)

大量體外研究表明氯喹具有廣譜抗病毒活性，但因為在整體動物模型的藥效學研究中不夠深入，缺乏相應的基礎性研究，對于氯喹的抗病毒作用機制尚未得到科學的、統(tǒng)一的認識，這對于重新開發(fā)氯喹抗病毒的治療作用有一定阻礙。同時，人類對病毒的認知、研究在不斷深入，但對于新發(fā)現(xiàn)的病毒如何入侵人體、導致發(fā)病的機制等方面仍需進行大量的科學研究。在臨床上，補充新的臨床數(shù)據(jù)對重新評價氯喹新的治療作用有積極促進作用。目前，國內(nèi)已有20多項關(guān)于氯喹及其衍生物對新型冠狀病毒肺炎的臨床試驗研究，這將有助于全面、科學的評價氯喹對新型冠狀肺炎的臨床療效。因此我們也需要重新評估氯喹及其衍生物在新型冠狀肺炎的用藥劑量和安全性，注意聯(lián)用其他藥物治療的相互作用，加強對不良反應的監(jiān)測，為患者提供臨床有效、安全用藥方案，這些需要在臨床試驗中進一步明確。