徐強(qiáng) 涂丁元 趙仙先

真核生物編碼基因中包含外顯子和內(nèi)含子，在基因表達(dá)的過程中，細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄生成的前體mRNA在剪接復(fù)合體的作用下，以不同的剪接方式對(duì)外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行組合，產(chǎn)生不同mRNA剪接異構(gòu)體的過程叫可變剪接。高通量測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，人類基因中95%以上的多外顯子基因存在可變剪接［1］。在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)中，可變剪接極大地拓展了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性和多樣性，對(duì)真核生物的基因表達(dá)具有重要意義，而異常的可變剪接也與多種心血管疾病有關(guān)。

1 可變剪接與心臟發(fā)育

可變剪接參與調(diào)控心臟生長(zhǎng)發(fā)育［2］。心臟中的可變剪接模式在圍產(chǎn)期和成年期有較大差異。L-型鈣通道廣泛調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞的各種功能，Cav1.2蛋白是心肌細(xì)胞L-型鈣通道大分子蛋白混合物中的一員。編碼Cav1.2蛋白的CACNA1C基因可通過互斥外顯子的可變剪接形式生成Cav1.2的剪接異構(gòu)體Cav1.2e21+22。這種剪接異構(gòu)體在新生兒心臟中高表達(dá)，而在成年人心臟中含量很少。Hu等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血模型和心力衰竭（心衰）患者中Cav1.2e21+22 表達(dá)水平升高，導(dǎo)致Cav1.2蛋白生成減少及鈣離子內(nèi)流障礙，最終引起心衰。Giudice等［4］利用高通量測(cè)序技術(shù)在全轉(zhuǎn)錄組水平上研究小鼠出生后心臟中剪接模式的變化，發(fā)現(xiàn)剪接調(diào)控因子CELF1和MBNL1通過影響心肌細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸和內(nèi)膜動(dòng)態(tài)流動(dòng)過程參與可變剪接的調(diào)控。在這一過程中，CELF1的表達(dá)上調(diào)，而MBNL1的表達(dá)下調(diào)。在成年小鼠心臟中復(fù)制CELF1的胚胎表達(dá)模式會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞橫小管組織破壞及鈣離子釋放障礙。Wang等［5］首次利用高通量測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)胎兒和成人心臟進(jìn)行了全基因組分析，發(fā)現(xiàn)可變剪接事件的差異主要存在于外顯子中。與成人心臟相比，胎兒心臟中的內(nèi)含子保留較多，提示內(nèi)含子保留可能與人類心臟發(fā)育有關(guān)。進(jìn)一步分析表明胎兒心臟中的特異性可變剪接事件主要集中于細(xì)胞增殖過程中，而成人主要集中于能量代謝過程中。

2 可變剪接與心肌病

心肌病是一組由不同原因引起的異質(zhì)性心肌疾病，多表現(xiàn)為心室肥厚或擴(kuò)張，可變剪接是心肌細(xì)胞病理變化過程中重要的調(diào)控形式。

富含絲氨酸和精氨酸（serine/arginine-rich，SR）蛋白家族是一類RNA結(jié)合蛋白，參與剪接體的組裝和可變剪接的調(diào)控過程。既往大量研究表明SR蛋白家族成員如絲氨酸/精氨酸富集剪接因子（SRSF）1、SRSF2、SRSF3和SRSF10等在心肌肥厚和心臟擴(kuò)大的病理過程中發(fā)揮重要作用。剪接因子SRSF3介導(dǎo)mTOR 基因前體mRNA 的剪接過程。特異性敲除小鼠心肌細(xì)胞中的SRSF3會(huì)導(dǎo)致mTOR基因生成較短的剪接異構(gòu)體，造成下游分子真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1磷酸化減少和心臟收縮相關(guān)基因如TNNT2、MYH6、RYR2等表達(dá)降低，最終引起小鼠心室容積擴(kuò)大、心臟射血分?jǐn)?shù)下降和心衰［6］。

互斥外顯子是一種常見的可變剪接類型，通過互斥外顯子，MEF2a基因可產(chǎn)生兩種不同的轉(zhuǎn)錄本：包含外顯子α1的轉(zhuǎn)錄本和包含外顯子α2的轉(zhuǎn)錄本。Gao 等［7］發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中，剪接因子RBFox1調(diào)控基因MEF2a外顯子α1和α2的互斥剪接過程。在心衰小鼠模型中增加RBFox1的表達(dá)會(huì)引起MEF2a基因剪接模式變化，表現(xiàn)為包含外顯子α1的轉(zhuǎn)錄本生成增加，減輕心衰小鼠心肌肥厚程度，延緩心衰進(jìn)程。

在可變剪接的調(diào)控過程中，除了剪接體的成分發(fā)生變化外，剪接位點(diǎn)的突變同樣可引起心肌細(xì)胞病理變化。Groeneweg等［8］使用Sanger測(cè)序法分析9個(gè)致心律失常性右室心肌病患者的剪接位點(diǎn)變異情況，發(fā)現(xiàn)DSG2、PKP2和JUP等基因發(fā)生剪接位點(diǎn)的突變，造成外顯子跳躍等異?？勺兗艚邮录陌l(fā)生，引起心肌細(xì)胞間橋粒功能障礙，最終導(dǎo)致致心律失常性右室心肌病。TTN 是編碼肌節(jié)中肌聯(lián)蛋白的基因，約25%的特發(fā)性家族性擴(kuò)張型心肌病患者中存在TTN 基因的無義突變。Herman等［9］使用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了TTN無義突變導(dǎo)致特發(fā)性家族性擴(kuò)張型心肌病的機(jī)制。約30%的TTN 無義突變發(fā)生在剪接位點(diǎn)上，這些突變改變了TTN 基因轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度，從而影響了心肌的順應(yīng)性，導(dǎo)致特發(fā)性家族性擴(kuò)張型心肌病。

3 可變剪接與心律失常

可變剪接與長(zhǎng)QT 綜合征、Brugada綜合征等心律失常疾病的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。在心肌細(xì)胞中，KCNQ1基因編碼延遲整流鉀通道，其7號(hào)外顯子5′端剪接位點(diǎn)的突變可產(chǎn)生外顯子跳躍的可變剪接類型。這種剪接位點(diǎn)突變生成的剪接異構(gòu)體中不含7號(hào)外顯子，導(dǎo)致鉀通道功能喪失和電流減少，最終引起長(zhǎng)QT 綜合征［10］。編碼心肌細(xì)胞鉀通道的另一種基因KCNH2也可通過10號(hào)外顯子5′端剪接位點(diǎn)的突變產(chǎn)生保留10號(hào)內(nèi)含子的剪接異構(gòu)體，這也是長(zhǎng)QT 綜合征的病因之一［11］。心肌細(xì)胞中的CAMK2D基因編碼調(diào)節(jié)興奮-收縮偶聯(lián)的鈣調(diào)蛋白激酶，其可變剪接過程受剪接因子RBM20調(diào)控。CaMK2D功能失調(diào)引起的經(jīng)肌漿網(wǎng)鈣離子釋放增多及細(xì)胞內(nèi)鈣超載是室性心律失常的主要病理改變之一［12］。研究發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞特異性敲除RBM20的小鼠中，CAMK2D基因產(chǎn)生異常的剪接異構(gòu)體，引起鈣離子經(jīng)L型鈣通道內(nèi)流增加和肌漿網(wǎng)鈣濃度升高，最終導(dǎo)致室性心律失常［13］。

4 可變剪接和血管疾病

可變剪接可通過影響脂質(zhì)代謝、改變離子通道通透性等機(jī)制參與血管疾病的進(jìn)程。

既往大量研究表明氧化低密度脂蛋白（ox LDL）可通過參與泡沫細(xì)胞形成、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和引起動(dòng)脈內(nèi)膜損傷等機(jī)制，在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中發(fā)揮作用。表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的OLR1基因編碼的低密度脂蛋白受體可特異性結(jié)合、吞噬和降解ox LDL。Tejedor等［14］發(fā)現(xiàn)OLR1基因5號(hào)外顯子剪接位點(diǎn)的突變可通過外顯子跳躍的方式產(chǎn)生包含5號(hào)外顯子的剪接異構(gòu)體，抑制ox LDL降解，從而導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。ACNA1C 基因的可變剪接不僅與心臟發(fā)育有關(guān)，而且參與高血壓的病理過程。在血管平滑肌細(xì)胞中，CACNA1C 基因轉(zhuǎn)錄生成的前體mRNA 中包含兩個(gè)重要的外顯子exon9* 和exon33，可影響鈣離子通道的電生理特征，其中exon9*是由Tang等［15］通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的新的外顯子，尚未收錄于Cav1.2蛋白的轉(zhuǎn)錄組文庫中，因其位置位于外顯子exon9和exon10之間，所以命名為exon9*。Zhou等［16］證明了在血管平滑肌中敲低剪接因子Rbfox2 會(huì)改變exon9* 與exon33的比值，進(jìn)而導(dǎo)致鈣離子通道功能障礙，最終引起血管肌張力增高和高血壓。

5 可變剪接的臨床應(yīng)用

異常可變剪接能作為臨床上的治療靶點(diǎn)，提供精準(zhǔn)的靶向治療方案。反義寡核苷酸（ANOs）是一段經(jīng)過化學(xué)修飾的單鏈寡核苷酸，可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與前體mRNA上各種剪接調(diào)控元件結(jié)合，從而在空間上阻斷RNA結(jié)合蛋白作用于相應(yīng)的剪接調(diào)控元件，使特定的外顯子在拼接過程中與內(nèi)含子一起被忽略，達(dá)到調(diào)控可變剪接的目的［17］。已經(jīng)應(yīng)用這種方法治療如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）［18］、脊髓性肌肉萎縮癥［19］以及強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良［20］等。DMD是由編碼抗肌萎縮蛋白的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的一種遺傳性神經(jīng)肌肉疾病，DMD 基因突變使蛋白質(zhì)翻譯過程提前終止，患者缺乏抗肌萎縮蛋白，表現(xiàn)為嚴(yán)重的肌無力，最終死于呼吸衰竭或心衰。AONs可通過外顯子跳躍的方式跳過特定的基因位點(diǎn)，避免抗肌萎縮蛋白發(fā)生截?cái)嗤蛔?，進(jìn)而恢復(fù)其功能［21］。美國(guó)FDA 于2016年批準(zhǔn)Exondys 51（eteplirsen）注射劑用于治療DMD，eteplirsen適用于抗肌萎縮蛋白基因51號(hào)外顯子突變的患者，這類人群約占DMD患者總數(shù)的13%。取得了良好的臨床療效［22］。

反式剪接是指不同的前體mRNA 分子經(jīng)過剪接形成成熟mRNA分子的過程，已成為基因治療的手段之一。針對(duì)突變靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的前體mRNA 通過病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞后與突變基因轉(zhuǎn)錄生成的前體mRNA發(fā)生反式剪接，最終整合修復(fù)為一條結(jié)構(gòu)正常的成熟mRNA，這種技術(shù)稱為剪接體介導(dǎo)的RNA反式剪接，已應(yīng)用于DMD患者治療［23］。

未來的研究應(yīng)將從系統(tǒng)層面闡明可變剪接在心血管系統(tǒng)發(fā)育的各個(gè)階段及疾病進(jìn)程中的作用，并探索非編碼RNA的可變剪接對(duì)心血管疾病的影響。這些研究將加深我們對(duì)可變剪接在心血管疾病中作用的認(rèn)識(shí)，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個(gè)體化治療的發(fā)展提供幫助。