藍熊靜

(廣西壯族自治區(qū)糧油質(zhì)量檢測中心，南寧530031)

0 引言

民以食為天，食以糧為本，作為人口大國，我國的糧食安全問題一直是關(guān)乎國計民生的頭等大事。隨著人民對糧食的要求從“吃飽”到“吃好吃健康”的變化，我國糧食生產(chǎn)也由數(shù)量導(dǎo)向轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)量導(dǎo)向。真菌毒素污染是造成糧食質(zhì)量安全問題的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計，全世界食品供應(yīng)的25%受到真菌毒素的污染[1]，而我國是受真菌毒素污染最嚴重的國家之一。據(jù)國家糧食局統(tǒng)計，我國每年有3100萬t糧食在生產(chǎn)、儲存、運輸過程中被真菌毒素污染，約占糧食年總產(chǎn)量的6.2%[2]。

適宜的環(huán)境條件容易滋生產(chǎn)毒真菌，真菌毒素是真菌在生長過程產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、付馬毒素等。其污染范圍廣泛，玉米、小麥、大麥、花生等谷物以及干果、水果、中藥材、牛奶等都容易被真菌毒素污染，尤其易污染谷物類等糧食作物[3]。由于真菌毒素具有致畸、致癌、致突變等特性，易延伸至食物鏈，對人和動物健康帶來嚴重危險[4]。

為了能夠“把中國人的飯碗牢牢端在中國人自己手上”，適應(yīng)我國糧食生產(chǎn)、儲存、流通以及監(jiān)管的要求，雖然已經(jīng)有很多準確檢測真菌毒素的實驗室方法，但把風(fēng)險控制在前端更為重要，因此在糧食檢測中應(yīng)用好真菌毒素的快檢技術(shù)具有重要的意義[5]。本文系統(tǒng)介紹了關(guān)于糧食中真菌毒素的主要快速檢測技術(shù)和裝備，對其優(yōu)缺點進行分析，并從實際應(yīng)用和需求出發(fā)，結(jié)合糧食真菌毒素快速檢測技術(shù)的驗證評價工作經(jīng)驗，預(yù)測了該領(lǐng)域技術(shù)的發(fā)展方向，以期對我國糧食質(zhì)量安全快檢領(lǐng)域的良性發(fā)展提供參考。

1 各種真菌毒素快速檢測技術(shù)優(yōu)缺點及發(fā)展應(yīng)用

真菌毒素現(xiàn)有檢測方法比較多，包括生物鑒定法、化學(xué)分析法、儀器分析法和免疫分析法等。生物鑒定法專一性不強；化學(xué)分析法精確度低；儀器分析靈敏度高，可準確定量，但樣本前處理復(fù)雜并且檢測儀器昂貴，難以在基層實驗室推廣使用[6]；免疫分析法是最早研究的快速檢測技術(shù)，也是目前市場上應(yīng)用最多的快速檢測方法。由于我國糧食現(xiàn)場收購特點，對真菌毒素的快速定量檢測技術(shù)發(fā)展應(yīng)用要求迫切，相關(guān)部門也在加快研究推進糧食中真菌毒素快速檢測技術(shù)的發(fā)展，并制定相關(guān)行業(yè)標(biāo)準，力爭進一步提高檢測技術(shù)，保證糧食質(zhì)量安全。目前的真菌毒素快速檢測方法主要有免疫分析法、無損檢測法等新型檢測方法，免疫分析法應(yīng)用得比較多。

1.1 免疫分析法

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的小分子有毒代謝產(chǎn)物，通過與蛋白質(zhì)等大分子載體結(jié)合而成為人工抗原[7]。免疫分析法是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)以及抗體或抗原(含半抗原)上標(biāo)記物的信號放大作用，實現(xiàn)對微量殘留物的定性定量檢測。其靈敏度高、檢測成本低、方便快速，是目前最具有代表性的真菌毒素等小分子污染物快速檢測技術(shù)[8]。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫分析快速檢測技術(shù)可分為膠體金免疫層析法、熒光免疫分析法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法、免疫傳感器法和免疫芯片檢測法等。

1.1.1 膠體金免疫層析法

該法是通過將抗原或抗體包被于固相載體硝酸纖維素膜上，檢測時，待檢樣本與標(biāo)記探針經(jīng)層析作用，與包被的抗原或抗體發(fā)生特異反應(yīng)，聚集后顯現(xiàn)信號條帶，可通過肉眼對結(jié)果進行定性判定，同時也可借助信號采集儀器進行定量分析。制備穩(wěn)定的膠體金標(biāo)記物是膠體金產(chǎn)品的一個技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致膠體金產(chǎn)品容易出現(xiàn)批間差較大的情況，這就對膠體金產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝提出更高的要求。真菌毒素膠體金定量檢測卡的主要代表廠家是美國的cham公司。cham的產(chǎn)品很早就占據(jù)了國內(nèi)糧食真菌毒素的快速檢測市場，目前依然占據(jù)很大的份額。

膠體金免疫層析快檢技術(shù)，是目前糧食真菌毒素快檢設(shè)備選擇的主流技術(shù)，經(jīng)過十幾年的研究發(fā)展，基本實現(xiàn)準確、快速、簡便、穩(wěn)定的快速檢測要求。真菌毒素的抗體包括高特異性抗體和廣譜抗體，可以滿足單種或多種的檢測需求。在保證檢測結(jié)果準確的前提下，人們嘗試統(tǒng)一前處理方法和采用“環(huán)境友好”的前處理試劑，適配體、受體技術(shù)、納米抗體等新技術(shù)在真菌毒素測中得到了應(yīng)用[9]，以膠體金試紙條為基礎(chǔ)的多重檢測模式已成為快速檢測領(lǐng)域的研究重點。

1.1.2 熒光免疫層析法

標(biāo)記取代酶聯(lián)免疫檢測法中的酶標(biāo)記，通過檢測熒光信號對結(jié)果進行測定的熒光免疫技術(shù)屬于發(fā)展較早的標(biāo)記免疫技術(shù)，相對吸光度檢測，具有更高的檢測靈敏度，可滿足對特殊靶物質(zhì)微量或超微量的檢測需求。常見的熒光免疫分析法包括熒光免疫分析(IFMA)、熒光偏振免疫分析(FPlA)、熒光激發(fā)共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析(FRETIA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)和多組分免疫分析。

熒光免疫層析法的穩(wěn)定性好，有效克服了膠體金免疫層析技術(shù)批間差大的弱點；其次，TRFIA靈敏度高，在前處理方面改進的空間更大。目前市場廣泛推廣的快速檢測技術(shù)產(chǎn)品中，熒光免疫層析技術(shù)也是主流之一。

1.1.3 酶聯(lián)免疫法

其基本原理是采用抗原或抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。酶聯(lián)免疫吸附分析法作為真菌毒素最為常用的免疫學(xué)檢測方法，具有高靈敏度和高特異性的特點，并且樣本前處理簡單，可對批量樣本進行低成本、快速篩查。按反應(yīng)機制可以將酶聯(lián)免疫法分為以下幾種：雙抗體夾心法、雙位點一步法、間接法測抗體、競爭法、捕獲法。酶聯(lián)免疫檢測法適合基層單位對樣本的快速篩查，陽性結(jié)果后續(xù)可經(jīng)儀器法確證，方便大規(guī)模推廣使用。

1.1.4 化學(xué)發(fā)光免疫法

化學(xué)發(fā)光免疫法將免疫反應(yīng)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光檢測儀對信號進行測定，化學(xué)發(fā)光具有熒光特性，無需激發(fā)光源，可避免信號在采集和分析時的干擾。根據(jù)標(biāo)記物不同可分為化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析[10]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析通過魯米諾或吖啶酯類等試劑直接標(biāo)記抗體或抗原實現(xiàn)檢測。

1.1.5 免疫傳感器法

免疫傳感器法將免疫學(xué)反應(yīng)與傳感器技術(shù)相結(jié)合，基于抗原抗體的反應(yīng)為檢測的特異性提供保證，同時傳感器技術(shù)具有高靈敏度，從而實現(xiàn)對待檢物質(zhì)的精準檢測。根據(jù)免疫傳感器中換能器的不同，可分為電化學(xué)免疫傳感器、質(zhì)量檢測免疫傳感器、熱量檢測免疫傳感器和光學(xué)免疫傳感器。該方法在食品安全監(jiān)測、環(huán)境中有毒有害物質(zhì)和癌癥標(biāo)志物檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，目前也已成為真菌毒素等小分子的有效檢測手段。

1.1.6 免疫芯片檢測法

芯片模式可對大量樣本中多種分析物進行同時定性檢測或定量分析。免疫芯片又稱抗體芯片，是目前最重要和研究最多的一種新型蛋白芯片檢測技術(shù)，基于抗原抗體間特異性反應(yīng)，可分為固相和液相兩種模式。免疫芯片檢測法在臨床疾病診斷、藥物篩選、環(huán)境中有毒有害物質(zhì)檢測和食品安全監(jiān)管領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用，在真菌毒素檢測方面，固相和液相芯片檢測模式均有相關(guān)報道。

1.2 真菌毒素?zé)o損檢測法

無損檢測技術(shù)作為一門新興的檢測技術(shù)日益受到廣泛關(guān)注?？梢栽诓黄茐霓r(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用樣品的光學(xué)、電學(xué)、聲學(xué)等特性，結(jié)合現(xiàn)代信息處理技術(shù)，對農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)進行準確、快速檢測[14]。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，以近紅外光譜、高光譜圖像以及電子鼻為代表的無損檢測技術(shù)在糧食受真菌毒素污染的檢測上也取得了積極進展，但總體還處于初步探索的階段[11，12，13]。目前無損檢測主要用于定性篩分，定量檢測研究不夠多，限制了其應(yīng)用范圍[14]。

2 糧食中真菌毒素快速檢測技術(shù)的應(yīng)用驗證評價方法

近年來糧食產(chǎn)業(yè)鏈中，很多企業(yè)和庫點都配備了相應(yīng)的真菌快檢設(shè)備，但是不少客戶對真菌毒素快檢設(shè)備的應(yīng)用持觀望態(tài)度，主要原因是對快檢儀器的準確性上把握不好，缺乏指導(dǎo)性的驗證方案，來確保檢測結(jié)果準確性。為了加快推進真菌毒素快速檢測技術(shù)的應(yīng)用和推廣，參照我國糧食行業(yè)標(biāo)準中設(shè)備和方法標(biāo)準適用性驗證及結(jié)果評價一般原則[15]，結(jié)合2019年我國糧食局組織開展的真菌毒素快速檢測驗證會（對十幾個國內(nèi)外真菌毒素快速檢測生產(chǎn)廠商的儀器、方法和耗材進行驗證）工作經(jīng)驗，提出如下真菌毒素快速檢測技術(shù)驗證方案：

2.1 具體驗證方案

真菌毒素主要污染的糧食及制品有稻谷、小麥、玉米、油脂，常檢測的項目為AFB1、DON、ZEN。真菌毒素快速檢測技術(shù)主要通過如下項目：檢出限、定量限、準確性、臺間差、重復(fù)性、穩(wěn)定性和單樣檢測時間等來對其整體技術(shù)進行驗證。

2.1.1 檢出限和定量限

隨機挑選一臺設(shè)備，一般選擇實驗室檢出率高的樣品類型，采用對應(yīng)真菌毒素各種類型的陰性樣品、分別各自獨立測定20次。

2.1.2 準確性和臺間差測試

兩臺設(shè)備，每個真菌毒素選兩種樣品類型，分別進行6個濃度梯度的雙試驗測定（每臺設(shè)備、每個水平2個數(shù)據(jù)）；兩臺設(shè)備測定值采用同一個樣品提取液分別在兩條測試卡上點樣，各自讀卡器中讀數(shù)。

6個梯度濃度點，選擇在定量限到3倍產(chǎn)品限量間。樣品準備，通過計算后，采用不同梯度濃度，稱量對應(yīng)量陽性樣品（有證的標(biāo)準實物），補足陰性樣品量到實驗總稱樣量。

2.1.3 重復(fù)性測試

選取一臺測試設(shè)備，對中等水平濃度（一般選擇產(chǎn)品限量）的不同類型真菌毒素，分別獨立測定6次。

2.1.4 穩(wěn)定性測試

隨機挑選一臺儀器對常檢測的一種真菌毒素的標(biāo)準溶液（或自帶的標(biāo)準卡）進行連續(xù)12h測試，每小時測定一個數(shù)據(jù)，共13個數(shù)據(jù)。

2.1.5 檢測時間的確定

從稱樣開始計時，到記錄數(shù)據(jù)結(jié)束，記錄下檢測一個單樣品的完整時間。

2.1.6 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果評價樣品的前處理，稱量應(yīng)嚴格按照標(biāo)準要求進行，如實記錄在檢測過程中出現(xiàn)的問題等內(nèi)容，對設(shè)備外觀、操作方便性等方面亦應(yīng)該進行評價。

2.1.6 .1檢出限采用20個陰性樣品檢測值的均值，加上3倍標(biāo)準偏差計算。

2.1.6 .2定量限采用20個陰性樣品檢測值的均值，加上10倍標(biāo)準偏差計算。

2.1.6 .3準確性采用測定值與定值進行配對T檢驗，考察兩方法的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異。

2.1.6 .4重復(fù)性采用X2檢驗，將國家標(biāo)準方法中規(guī)定的重復(fù)性要求轉(zhuǎn)換成標(biāo)準差，考察重復(fù)性標(biāo)準差是否超過標(biāo)準方法中給定的標(biāo)準差。

2.1.6 .5穩(wěn)定性采用X2檢驗，將國家標(biāo)準方法中規(guī)定的重復(fù)性要求轉(zhuǎn)換成標(biāo)準差，考察穩(wěn)定性標(biāo)準差是否超過標(biāo)準方法中給定的標(biāo)準差。

2.1.6 .6臺間差兩臺設(shè)備測定均值進行配對T檢驗，考察兩臺設(shè)備的測定結(jié)果是否存在顯著性差異。

根據(jù)各項數(shù)據(jù)檢測結(jié)果，按照評價規(guī)則和對應(yīng)國家標(biāo)準對每個項目的各項指標(biāo)具體要求，參考操作的便捷性和時效性，最后對該真菌毒素快檢設(shè)備進行全面結(jié)果評價。

在實際的糧食真菌毒素快速檢測工作中，基層單位和企業(yè)可以按照自己的具體情況，選擇用質(zhì)控樣品或留樣復(fù)測以及比對等方式對整個檢測過程進行質(zhì)量控制；特別是對檢測的臨界值樣品要用其他方法進行比對、確認，以防檢測結(jié)果的假陽性和陰性[16]，并據(jù)使用頻率自行確定驗證周期。

3 結(jié)語

為了保障國家糧食質(zhì)量安全，對糧食中真菌毒素的風(fēng)險監(jiān)控刻不容緩。近幾年新型儀器分析法和以免疫為基礎(chǔ)的分析法發(fā)展迅速，其以簡單、快速、低毒、易操作的優(yōu)勢，彌補了現(xiàn)行國家標(biāo)準方法的不足，更適合糧油等農(nóng)產(chǎn)品收購現(xiàn)場快速檢測的需要，是目前真菌毒素科研分析領(lǐng)域的主流，并陸續(xù)納入行業(yè)標(biāo)準范圍之內(nèi)。多種真菌毒素混合污染的情況時有發(fā)生，并且隨著全社會關(guān)注度的提高，單一定性已不能滿足未來的檢測需求。未來真菌毒素檢測技術(shù)既需要不斷提高確證性實驗分析水平，實現(xiàn)對痕量目標(biāo)物的準確定量，也需要結(jié)合實踐，發(fā)展方便、多元、快速、低毒、準確及低成本的快速檢測技術(shù)。期待本文所述真菌毒素快速檢測應(yīng)用驗證評價方法，能對糧食基層工作者在快速檢測技術(shù)的實際應(yīng)用中提供有益參考。