曾 靜,郭建軍,袁 林

(江西省科學(xué)院微生物研究所,江西南昌 330096)

淀粉是自然界含量豐富的高分子聚糖,是各種生物的重要能量來(lái)源,也是一種重要的工業(yè)原材料[1-2]。在淀粉酶法制糖工業(yè)中,淀粉首先經(jīng)過α-淀粉酶水解,淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵被隨機(jī)切斷,淀粉由高聚糖水解為低聚糖,該過程稱為液化步驟[3-4]。液化步驟產(chǎn)生的低聚糖隨后在β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶以及普魯蘭酶的作用下,殘留的支鏈α-1,6-糖苷鍵和直鏈α-1,4-糖苷鍵被進(jìn)一步水解,最終形成葡萄糖漿,該過程稱為糖化步驟[5-6]。淀粉的液化步驟在95～105 ℃、pH6.0下進(jìn)行,糖化步驟條件則通常為60 ℃、pH4.5～5.5,由液化轉(zhuǎn)入糖化時(shí)需要降低溫度并加酸降低糖漿的pH,并且糖化過程中使用了多種水解酶[7-9]。這些因素使得淀粉制糖的生產(chǎn)成本增加,同時(shí)降低了生產(chǎn)效率。若某種淀粉酶在液化條件下可以同時(shí)進(jìn)行糖化,則既可以省去加酸堿調(diào)節(jié)pH的過程以簡(jiǎn)化工藝、降低成本,又可以有效地防止微生物污染,并且在液化的高溫下,還可以獲得較高的反應(yīng)速率。因此,人們希望將液化過程和糖化過程合并,能夠獲得一種在液化條件下具有較強(qiáng)的水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵能力的淀粉酶。

來(lái)源于極端嗜熱古生菌Thermococcuskodakarensis的嗜熱酸性普魯蘭水解酶Ⅲ Tk-PUL是同時(shí)具有α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的雙功能酶[10-13]。Tk-PUL是目前報(bào)道的水解活性最高的普魯蘭水解酶Ⅲ,并且Tk-PUL的酶學(xué)性質(zhì)(如熱穩(wěn)定、低pH、不依賴于Ca2+)使得其適用于淀粉酶法制糖工業(yè)[14]。Tk-PUL可同時(shí)水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵,能夠在高溫的液化條件下進(jìn)行糖化作用,可使淀粉制糖的糖化過程和液化過程合二為一,大大降低淀粉酶法制糖工業(yè)的生產(chǎn)成本,并提高生產(chǎn)效率。因此,嗜熱酸性普魯蘭水解酶Ⅲ Tk-PUL在淀粉酶法制糖工業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力。目前Tk-PUL已在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),重組Tk-PUL主要位于胞內(nèi)可溶成分中,從重組大腸桿菌中獲取Tk-PUL的純化過程復(fù)雜。另外大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌,其外膜成分中含有脂多糖。脂多糖會(huì)對(duì)人和動(dòng)物的健康產(chǎn)生不利影響,食品和制藥工業(yè)的最終產(chǎn)品中不能含有脂多糖,而去除脂多糖使得下游純化過程變得復(fù)雜,同時(shí)也增加了重組酶的生產(chǎn)成本。因此,為利于Tk-PUL在制糖工業(yè)中的應(yīng)用,需選用其他合適的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)獲取重組Tk-PUL?？莶菅挎邨U菌作為傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株,具有分泌表達(dá)能力強(qiáng)、培養(yǎng)條件和基因操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是理想的外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)宿主菌[15-17]。利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性,同時(shí)結(jié)合其自身信號(hào)肽,構(gòu)建分泌表達(dá)系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。

本研究通過構(gòu)建Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的信號(hào)肽篩選庫(kù),并結(jié)合高通量篩選方法,實(shí)現(xiàn)Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的高效分泌表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,對(duì)Tk-PUL的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究,為其在淀粉酶法制糖工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌BacillussubtilisRIK1285、重組質(zhì)粒pET26b-tkpul 由本實(shí)驗(yàn)室保存;LB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1 L 環(huán)凱生物科技有限公司;KOD-Plus-neo DNA聚合酶 日本Toyobo公司;DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 美國(guó)Fermentase公司;DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國(guó)Omega Bio-tek公司;BacillussubtilisSecretory Protein Expression System Cat.#3380(枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌表達(dá)試劑盒Cat.#3380)、In-Fusion? HD Cloning kit(In-Fusion? HD克隆試劑盒) 日本Takara公司;Chelating SepharoseTMFast Flow、Chelating SepharoseTMFast Flow 美國(guó)GE Healthcare公司;Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Mastercycler gradient PCR儀 美國(guó)Eppendorf公司;TY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;SP-752PC紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;Agilent 7500ce 美國(guó)Agilent公司;iMark 酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析 分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

1.2.2 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選庫(kù)的構(gòu)建 基于tkpul的堿基序列,設(shè)計(jì)引物P1和P2(表1),以重組質(zhì)粒pET26b-tkpul為模板,擴(kuò)增基因tkpul中不含信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)基因tkpulds。PCR擴(kuò)增條件為:98 ℃變性5 min;98 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,74 ℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);74 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NdeI和XbaI雙酶切,連接至載體pBE-S,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBE-S-tkpulds。按照BacillussubtilisSecretory Protein Expression System Cat.#3380(枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌表達(dá)試劑盒Cat.#3380)的說明書設(shè)計(jì)引物M1和E1(表1),以重組質(zhì)粒pBE-S-tkpulds為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒pBE-S-tkpulds的線性化。采用In-Fusion? HD Cloning kit(In-Fusion? HD克隆試劑盒)連接線性化DNA和枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌表達(dá)試劑盒中SP DNA混合物,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌表達(dá)試劑盒中StellarTM感受態(tài)細(xì)胞,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物全部涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上,于37 ℃過夜培養(yǎng)。收集LB固體平板上所有轉(zhuǎn)化子,提取其中所含重組質(zhì)粒。將所獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BacillussubtilisRIK1285,BacillussubtilisRIK1285感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化采用改進(jìn)的Spizizen法[19]進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化子涂布于含10 μg/mL卡那霉素的LB固體平板上,于37 ℃過夜培養(yǎng),即獲得Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選庫(kù)。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

注:下劃線標(biāo)注的部分為限制性酶切割位點(diǎn)。

1.2.3 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選庫(kù)的高通量培養(yǎng) 取滅菌、烘干的96孔深孔板,每孔加入LB培養(yǎng)基500 μL。用10 μL移液槍扎取槍頭后挑取單菌落,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)孔中輕輕洗吹幾次,棄掉槍頭,依次反復(fù)直至挑選結(jié)束。蓋上蓋子,于搖床中37 ℃、230 r/min過夜活化。用 8通道移液器按照順序?qū)⒒罨蟮姆N子液轉(zhuǎn)接至48 孔深孔板中,接種量為3%。蓋上蓋子,搖床中37 ℃、230 r/min開始發(fā)酵,培養(yǎng)時(shí)間為30 h。

1.2.4α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的高通量檢測(cè) 將發(fā)酵后的48 孔深孔板于4 ℃下4000 r/min離心10 min,離心后的上清用于α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的高通量檢測(cè)。取滅菌、烘干的96孔深孔板,每孔加入100 μL發(fā)酵液上清,然后加入100 μL反應(yīng)底物(1%可溶性淀粉或1%普魯蘭糖),于100 ℃反應(yīng)10 min后,向其中補(bǔ)加300 μL DNS[20]并沸水浴反應(yīng)10 min后，轉(zhuǎn)移至冰水浴中快速冷卻。取潔凈的酶標(biāo)板加入150 μL無(wú)菌水和50 μL反應(yīng)液并混勻,用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm下的吸光值[10]。吸光值的大小反映胞外Tk-PUL分泌量的多少。

1.2.5 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽的鑒定 選取Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽，篩選庫(kù)中α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性均較高的克隆子,設(shè)計(jì)引物P3和P4(表1)進(jìn)行菌落PCR,并將獲得的DNA片段送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast搜索,確定每個(gè)克隆子所對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽名稱。

1.2.6 Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)和純化 接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養(yǎng)基中,用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng),其中培養(yǎng)基的裝液量為20 mL,培養(yǎng)溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min,培養(yǎng)時(shí)間為10 h。然后轉(zhuǎn)接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中,用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng),其中培養(yǎng)基的裝液量為25 mL,接種量為3%,培養(yǎng)溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min,培養(yǎng)時(shí)間為30 h。

采用Ni2+親和層析柱對(duì)發(fā)酵上清液中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫,即得到純化后的重組酶。利用SDS-PAGE檢測(cè)重組酶的純度,采用活性印記分析[21]檢測(cè)重組酶的α-淀粉酶酶活和普魯蘭酶酶活,并采用Bradford法[22]測(cè)定重組酶的濃度。

1.2.7 Tk-PUL的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.7.1α-淀粉酶活性測(cè)定和普魯蘭酶活性測(cè)定 將10 μL純化后酶液與190 μL 含1%(W/V)可溶性淀粉或普魯蘭糖的50 mmol/L MES-NaOH,pH4.5緩沖液混合,于100 ℃反應(yīng)10 min后,用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖量。酶活力單位(U)定義:在一定反應(yīng)條件下,每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)U。

1.2.7.2 酶的最適反應(yīng)pH測(cè)定 將酶液與不同pH的底物混合,于100 ℃下測(cè)定不同pH下α-淀粉酶酶活和普魯蘭酶酶活。將所測(cè)得的最高酶活定義為100%,并以相對(duì)酶活的百分比對(duì)pH作圖,確定其最適反應(yīng)pH。采用不同緩沖液配制不同pH的底物:50 mmol/L MES(pH3.0～7.0)、50 mmol/L MOPS(pH7.0～9.0)。

1.2.7.3 酶的最適反應(yīng)溫度測(cè)定 按照上述反應(yīng)體系混合酶液和底物,分別于40～110 ℃反應(yīng)10 min,測(cè)定不同溫度下α-淀粉酶酶活和普魯蘭酶酶活,并以對(duì)比酶活力溫度作圖,確定其最適反應(yīng)溫度。其中,40～95 ℃范圍內(nèi)的反應(yīng)于水浴中進(jìn)行,100～110 ℃范圍內(nèi)的反應(yīng)于甘油浴中進(jìn)行。高溫條件下測(cè)定酶活性時(shí),反應(yīng)樣品置于O型環(huán)螺旋蓋密封管內(nèi),以防止水分蒸發(fā)。

1.2.7.4 酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定 在50 mmol/L MES-NaOH,pH4.5緩沖液中,酶液于100 ℃保溫,分時(shí)間梯度取出部分樣品,根據(jù)如上反應(yīng)體系測(cè)定α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。將未處理的酶液的酶活定義為100%,并以相對(duì)酶活的百分比對(duì)時(shí)間作圖,評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.7.5 酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 用50 mmol/L MES-NaOH,pH4.5緩沖液配制不同濃度的底物,分別向不同濃度底物中加入等量的酶液,按照如上反應(yīng)體系測(cè)定酶活。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),以比酶活力的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖,直線的斜率為Km/Vmax,截距為1/Vmax,計(jì)算以可溶性淀粉為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速度Vmax和反應(yīng)常數(shù)kcat?？扇苄缘矸鄣臐舛忍荻仍O(shè)定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL;普魯蘭糖的濃度梯度設(shè)定為1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、20.0 mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選庫(kù)的高通量篩選

枯草芽孢桿菌是理想的外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)宿主菌[16],外源蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)依賴于枯草芽孢桿菌信號(hào)肽的引導(dǎo),并且信號(hào)肽與外源蛋白質(zhì)之間存在適配性。因此針對(duì)特定的蛋白質(zhì)需要選擇合適的信號(hào)肽來(lái)實(shí)現(xiàn)有效地分泌表達(dá)[23-25]。目前尚無(wú)法預(yù)測(cè)哪種信號(hào)肽能夠高效引導(dǎo)目的蛋白質(zhì)分泌到胞外,只能通過實(shí)驗(yàn)手段從大量信號(hào)肽中篩選得到高效引導(dǎo)目的蛋白質(zhì)分泌到胞外的信號(hào)肽。

本研究基于以下三點(diǎn)探索了Tk-PUL在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)的條件:首先構(gòu)建了引導(dǎo)Tk-PUL分泌表達(dá)的信號(hào)肽篩選庫(kù);其次將搖瓶的發(fā)酵參數(shù)引入至深孔板水平,建立了基于深孔板的高通量培養(yǎng)技術(shù);再次將常規(guī)的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性測(cè)定方法移植于96孔深孔板中,建立了α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的高通量檢測(cè)方法,并與高通量培養(yǎng)技術(shù)偶聯(lián)建立了信號(hào)肽篩選庫(kù)的高通量篩選方法。

本研究構(gòu)建Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)的信號(hào)肽篩選庫(kù),共獲得475個(gè)克隆子,對(duì)這475個(gè)克隆子進(jìn)行胞外上清液的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性檢測(cè),實(shí)現(xiàn)信號(hào)肽篩選庫(kù)的初篩。從以上475克隆子選取其中酶活較高的50個(gè)克隆子,并對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩,這50個(gè)克隆子的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖1～圖5所示。對(duì)于1～50號(hào)克隆子,其α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性之間存在一定的倍數(shù)關(guān)系,普魯蘭酶活性約為α-淀粉酶活性的2倍。此外,30號(hào)克隆子具有最高的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性,這表明30號(hào)克隆子的胞外重組酶分泌量最高。選取胞外上清液α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性較高的克隆子進(jìn)行信號(hào)肽的進(jìn)一步鑒定。

圖1 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選克隆子的 酶活檢測(cè)結(jié)果(1～10號(hào)克隆子)Fig.1 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 1～10)

圖2 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選克隆子的 酶活檢測(cè)結(jié)果(11～20號(hào)克隆子)Fig.2 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 11～20)

圖3 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選克隆子的 酶活檢測(cè)結(jié)果(21～30號(hào)克隆子)Fig.3 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 21～30)

圖4 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選克隆子的 酶活檢測(cè)結(jié)果(31～40號(hào)克隆子)Fig.4 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 31～40)

圖5 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選克隆子的 酶活檢測(cè)結(jié)果(41～50號(hào)克隆子)Fig.5 Enzyme activity detection results of secretory expression signal peptide screening clones of Tk-PUL(clones number 41～50)

2.2 Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽的鑒定

從Tk-PUL分泌表達(dá)信號(hào)肽篩選庫(kù)中選取酶活高的10個(gè)克隆子(9號(hào)、10號(hào)、20號(hào)、29號(hào)、30號(hào)、39號(hào)、40號(hào)、48號(hào)、49號(hào)、50號(hào)),采用引物P3和P4進(jìn)行菌落PCR,并將獲得的DNA片段(如圖6所示)送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast搜索,確定每個(gè)克隆子所對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽名稱。其中9號(hào)克隆子對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽為BglC,10號(hào)和30號(hào)克隆子對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽為AmyE,20號(hào)、39號(hào)和48號(hào)克隆子對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽為Mpr,29號(hào)克隆子對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽為NprE,40號(hào)、49號(hào)和50號(hào)克隆子對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽為Bpr。結(jié)合以上克隆子的胞外α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性檢測(cè)結(jié)果,即30號(hào)克隆子具有最高的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性,10號(hào)克隆子次之,可以得出以下結(jié)論:針對(duì)于Tk-PUL,信號(hào)肽AmyE的引導(dǎo)分泌效率最高。

圖6 信號(hào)肽篩選克隆子的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of signal peptide screening clones

注:M. DL2000 ladder;1.9號(hào)克隆子;2.10號(hào)克隆子;3.20號(hào)克隆子;4.29號(hào)克隆子;5.30號(hào)克隆子;6.39號(hào)克隆子;6.40號(hào)克隆子;8.48號(hào)克隆子;9.49號(hào)克隆子;10. 50號(hào)克隆子;11.轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pBE-S-tkpulds的重組枯草芽孢桿菌。

2.3 重組Tk-PUL的分泌表達(dá)與純化

接種30號(hào)克隆子的單克隆到LB液體培養(yǎng)基中,用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng),其中培養(yǎng)基的裝液量為20 mL,培養(yǎng)溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為230 r/min,培養(yǎng)時(shí)間為10 h。然后轉(zhuǎn)接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中,用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為30 h。待發(fā)酵結(jié)束后,對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性檢測(cè)。酶活測(cè)定結(jié)果顯示,重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力為29.1 U/mL,胞外普魯蘭酶活力為53.5 U/mL。

采用Ni2+親和層析柱對(duì)發(fā)酵上清液中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,用200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫,即得到純化后的重組酶。利用SDS-PAGE檢測(cè)重組酶的純度,并采用活性印記分析檢測(cè)重組酶的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性,結(jié)果如圖7所示。Tk-PUL的分子量約為86 kDa,并且活性印記分析結(jié)果顯示Tk-PUL能夠降解可溶性淀粉和普魯蘭糖,即Tk-PUL同時(shí)具有α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。

圖7 Tk-PUL的SDS-PAGE檢測(cè)以及活性印記分析Fig.7 SDS-PAGE and activity staining analysis of Tk-PUL

注:M:蛋白質(zhì)Marker;1:Tk-PUL的SDS-PAGE檢測(cè);2:Tk-PULα-淀粉酶活性的活性印記分析;3:Tk-PUL普魯蘭酶活性的活性印記分析。

2.4 重組Tk-PUL的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 pH對(duì)重組Tk-PUL相對(duì)酶活的影響 將酶液與不同pH(3.0～9.0)的1%(W/V)可溶性淀粉溶液或普魯蘭糖溶液混合,于100 ℃下測(cè)定重組Tk-PUL的相對(duì)α-淀粉酶活性或普魯蘭酶活性,結(jié)果如圖8所示。以可溶性淀粉或普魯蘭糖為底物時(shí),Tk-PUL的最適反應(yīng)pH均為4.5,并且在pH3.5～8.0范圍內(nèi)均具有50%以上相對(duì)酶活。

圖8 pH對(duì)酶活的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

2.4.2 溫度對(duì)重組Tk-PUL的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力的影響 以1%可溶性淀粉或1%普魯蘭糖為底物,于不同溫度條件下(40～110 ℃)測(cè)定重組Tk-PUL的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力,結(jié)果如圖9所示。以可溶性淀粉或普魯蘭糖為底物時(shí),重組Tk-PUL的最適反應(yīng)溫度均為100 ℃。在40～110 ℃間Tk-PUL的普魯蘭酶比活力均明顯高于α-淀粉酶比活力。其中,在100 ℃條件下,Tk-PUL的α-淀粉酶比活力為54.08 U/mg,普魯蘭酶比活力比活力為110.39 U/mg。

圖9 溫度對(duì)酶活的影響Fig.9 Effect of temperature on enzyme activity

2.4.3 重組Tk-PUL的熱穩(wěn)定性 重組Tk-PUL于100 ℃下的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖10所示。以可溶性淀粉或普魯蘭糖為底物時(shí),重組Tk-PUL于100 ℃、pH4.5的半衰期均約為2 h。即Tk-PUL的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性于100 ℃的半衰期均約為2 h。

圖10 100 ℃重組Tk-PUL的熱穩(wěn)定性Fig.10 Thermal stability of recombinant Tk-PUL at 100 ℃

2.4.4 重組Tk-PUL的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 重組Tk-PUL以可溶性淀粉或普魯蘭糖為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km和反應(yīng)常數(shù)kcat如表2所示。以可溶性淀粉為底物時(shí),Tk-PUL的Km值為1.86 mg/mL,kcat值為80.9 s-1;以普魯蘭糖為底物時(shí),Tk-PUL的Km值為2.07 mg/mL,kcat值為157.8 s-1。Tk-PUL對(duì)可溶性淀粉和普魯蘭糖的Km值相近,即Tk-PUL對(duì)可溶性淀粉和普魯蘭糖的結(jié)合能力基本一致;Tk-PUL對(duì)普魯蘭糖的kcat值約為其對(duì)可溶性淀粉的kcat值的2倍,即Tk-PUL以普魯蘭糖為底物時(shí)的反應(yīng)速率明顯高于以可溶性淀粉為底物時(shí)的反應(yīng)速率。

表2 100 ℃重組Tk-PUL的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of recombinant Tk-PUL at 100 ℃

3 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建Tk-PUL在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)的信號(hào)肽篩選庫(kù)并結(jié)合高通量篩選技術(shù),確定引導(dǎo)Tk-PUL在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)的信號(hào)肽為AmyE。在信號(hào)肽AmyE的引導(dǎo)下,重組Tk-PUL在重組枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá),重組枯草芽孢桿菌的胞外α-淀粉酶活力為29.1 U/mL,胞外普魯蘭酶活力為53.5 U/mL。并且枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)獲得的重組Tk-PUL的酶學(xué)性質(zhì)與大腸表達(dá)系統(tǒng)中胞內(nèi)表達(dá)獲得的重組Tk-PUL的酶學(xué)性質(zhì)[9-10]基本一致。以可溶性淀粉為底物時(shí),重組Tk-PUL的最適反應(yīng)pH為4.5,最適反應(yīng)溫度為100 ℃,對(duì)應(yīng)的絕對(duì)酶活為54.08 U/mg,動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值為1.86 mg/mL,kcat值為80.9 s-1,于100 ℃、pH4.5的半衰期約為2 h。以普魯蘭糖為底物時(shí),重組Tk-PUL的最適反應(yīng)pH為4.5,最適反應(yīng)溫度為100 ℃,對(duì)應(yīng)的絕對(duì)酶活為110.39 U/mg,動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值為2.07 mg/mL,kcat值為157.8 s-1,于100 ℃、pH4.5的半衰期約為2 h。本研究結(jié)果表明,在信號(hào)肽AmyE的引導(dǎo)下,嗜熱酸性普魯蘭水解酶Ⅲ Tk-PUL可在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效分泌表達(dá),這為Tk-PUL在淀粉酶法制糖工業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。此外,由Tk-PUL的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性具有相似的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH及熱穩(wěn)定性可以推斷,Tk-PUL的這兩種酶活性是由同一活性中心催化的。即Tk-PUL屬于單結(jié)構(gòu)域雙功能酶,為探索雙功能酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供了很好的研究素材。