葛麗麗，陳重芬，劉磊，鄭璇，宋銀森

(鄭州大學附屬兒童醫(yī)院&河南省兒童醫(yī)院&鄭州兒童醫(yī)院河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室，鄭州 450018)

家族性偏癱型偏頭痛(familial hemiplegic migraine，F(xiàn)HM)是一種罕見的常染色體顯性遺傳、具有先兆癥狀的偏頭痛[1]。本病由Clark等于1910年首次報道，是目前唯一明確的單基因遺傳偏頭痛，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)作性單側(cè)肢體無力，后出現(xiàn)偏頭痛伴發(fā)惡心嘔吐，其他先兆癥狀如視覺、感覺、言語等出現(xiàn)異常，通常在兒童或青春期起病[2]。本研究分析1例CACNA1A基因 c.4552G>A新生突變導致家族性偏癱型偏頭痛患兒的臨床及遺傳學特征，為完善和豐富該病的臨床-基因表型提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1一般資料 患兒，男，3歲8月齡，因“抽搐、嘔吐、左側(cè)肢體無力1 d”于2018年8月收入我院神經(jīng)內(nèi)科。2歲8月齡時曾出現(xiàn)左側(cè)肢體無力伴嘔吐，1 d后自行緩解。今再次出現(xiàn)相似癥狀，并伴視物模糊，抽搐、頭痛、獨坐易向左側(cè)傾倒。為求進一步治療，收入我院?；純合礕1P1，足月順產(chǎn)，生后無窒息搶救史，出生體重2.5 kg，身長不詳。母孕期體健，家族中無遺傳疾病史。FHM診斷標準參照HIS《國際頭痛疾病分類》(2004年)第二版：頭痛先兆必須包括完全可逆的肢體乏力，必須包括完全可逆的視覺、一般感覺和語言障礙這3項癥狀中的1項，家族中至少有一級或二級家屬有同樣的癥狀[3]。

1.2體格檢查 神志清，精神、飲食欠佳，呼吸平穩(wěn)，哭鬧時口角右歪，左眼閉合不全，左側(cè)鼻唇溝變淺。左側(cè)肢體活動障礙，右側(cè)肢體活動無受限，關(guān)節(jié)無紅腫。雙側(cè)膝腱反射、跟腱反射可引出，左側(cè)巴氏征陽性，左上肢肌力Ⅱ級，左下肢肌力Ⅲ級，肌張力低；右側(cè)肢體未見明顯異常。

1.3實驗室檢查 血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、心肌酶譜均正常；頭顱腦磁共振成像：右側(cè)顳頂枕葉及右側(cè)海馬脫髓鞘改變，右側(cè)大腦半球萎縮，右側(cè)腦室擴張。以上均由本院相關(guān)科室完成。

1.4基因檢測 經(jīng)患兒監(jiān)護人簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。抽取患兒及父母空腹靜脈全血各2 mL，EDTA-K2抗凝，送至北京邁基諾醫(yī)學檢驗所，按照QIAamp DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)說明書抽提基因組DNA，對患兒外顯子編碼區(qū)進行測序，并通過PCR擴增以及Sanger測序技術(shù)對篩選出的位點進行驗證。剩余全血及DNA樣本置于-20 ℃保存。以同期本院100例體檢健康者作為健康人對照。

1.5突變位點的生物信息學分析 利用SIFT、PolyPhen-2軟件預(yù)測錯義突變對蛋白質(zhì)功能的影響，應(yīng)用Mutation Taster軟件評估突變位點在物種間的保守性。采用SMART網(wǎng)站(http://smart.embl.de/)預(yù)測該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能分析。

2 結(jié)果

2.1基因檢測結(jié)果 通過全外顯子組基因測序發(fā)現(xiàn)，患兒CACNA1A基因第28號外顯子存在c.4552G>A突變。Sanger測序驗證顯示，其父母該位點均為野生型，患兒攜帶c.4552G>A突變?yōu)樽园l(fā)突變(圖1)。而在100例健康人對照者中均未檢測到該突變位點，排除其為多態(tài)性位點。

注：A，先證者攜帶c.4552G>A突變；B，父親未攜帶c.4552G>A突變；C，母親未攜帶c.4552G>A突變；箭頭示突變位點。

2.2突變位點的生物信息學分析結(jié)果 c.4552G>A(p.G1518R)突變經(jīng)蛋白質(zhì)功能預(yù)測軟件SIFT、PolyPhen-2預(yù)測結(jié)果均為“有害”(圖2A、2B)；Mutation Taster物種保守性分析顯示，CACNA1A蛋白第1 518位氨基酸在不同的物種間幾乎完全相同，表明在進化上高度保守(圖2C)。根據(jù)SMART網(wǎng)站預(yù)測，該位點位于CACNA1A蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。

3 討論

FHM是一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，是先兆偏頭痛(migraine with aura，MA)中的一種亞型[4]，多數(shù)在兒童或青春期起病，臨床主要表現(xiàn)為偏頭痛、可逆性單側(cè)肢體無力及其他先兆癥狀如視覺、感覺、言語先兆等。李芳芳等[5]報道,一CACNA1A基因突變導致的家族性偏癱型偏頭痛家系中的患者均出現(xiàn)視物模糊，可逆性單側(cè)肢體無力，持續(xù)10～20 min后自行緩解，隨之出現(xiàn)對側(cè)顳部疼痛，并伴惡心、嘔吐、畏聲、嗜睡。本例患兒出現(xiàn)視物模糊，10 min后出現(xiàn)左側(cè)肢體無力，持續(xù)15 min后緩解，隨后出現(xiàn)右側(cè)顳部頭痛、嘔吐，并伴抽搐、哭鬧時口角右歪，左眼閉合不全，左側(cè)鼻唇溝變淺等臨床癥狀。其臨床表現(xiàn)與上述文獻[4-5]報道的FHM的臨床表現(xiàn)相一致。

本研究采用外顯子組基因測序發(fā)現(xiàn)，患兒CACNA1A基因第28號外顯子存在c.4552G>A突變，該突變導致第1 518位氨基酸由甘氨酸變異為精氨酸，為錯義突變，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，c.4552G>A突變未出現(xiàn)在EXAC、ESP6500及千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫中，在100例健康人對照者中均未檢測到該突變，排除其為多態(tài)性位點。Sanger測序驗證顯示，其父母該位點均為野生型，患兒攜帶c.4552G>A突變?yōu)樽园l(fā)突變。研究證實，50%～75%的FHM是由CACNA1A基因突變所致[6-7]，已報道的CACNA1A基因突變形式有15種，且均為錯義突變。本實驗中檢測到的CACNA1A基因p.G1518R突變?yōu)閲鴥?nèi)外尚未報道過的新突變，經(jīng)蛋白質(zhì)功能預(yù)測軟件SIFT、PolyPhen-2預(yù)測結(jié)果均為“有害”。 根據(jù)SMART網(wǎng)站預(yù)測，CACNA1Ac.4552G>A突變導致第1 518位氨基酸由甘氨酸變異為精氨酸，該突變位點位于CACNA1A蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域(ion trans domain)中，該結(jié)構(gòu)域具有279個氨基酸，對應(yīng)的氨基酸位點為1 243至1 521位,主要參與膜結(jié)構(gòu)的形成、離子跨膜運輸過程以及離子通道活性。根據(jù)Mutation Taster軟件預(yù)測突變位點的致病性，得出結(jié)論:這一突變位點的改變，會引起蛋白質(zhì)氨基酸序列改變，可能會影響該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。

注：A，SIFT軟件預(yù)測值為0.14；B，PolyPhen-2軟件預(yù)測結(jié)果為0.997和0.960；C，Mutation Taster軟件預(yù)測該位點在不同的物種間完全相同；各縮寫含義:A，精氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，組氨酸；I，異亮氨酸；K，賴氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；V，纈氨酸；W，色氨酸； Y，酪氨酸。

圖2該突變位點的生物信息學分析

為進一步判定該位點的致病性，根據(jù)美國遺傳學與基因組學學會(ACMG)發(fā)布的《ACMG遺傳變異分類標準與指南》，該突變具備1個PS(突變位點為自發(fā)突變)+1個PM(在正常人群數(shù)據(jù)庫中的頻率為“-”，為低頻)，初步判定為“Likely pathogenic”。經(jīng)蛋白質(zhì)功能預(yù)測軟件SIFT、PolyPhen-2預(yù)測結(jié)果均為“有害”，Mutation Taster物種保守性分析顯示，CACNA1A蛋白第1 518位氨基酸在不同的物種間幾乎完全相同，表明其在進化上高度保守。

FHM是一種遺傳因素明顯的MA，臨床出現(xiàn)可逆性的單側(cè)肢體無力，繼而發(fā)生偏頭痛，惡心嘔吐等表現(xiàn)時，應(yīng)早期進行基因檢測，明確病因，及時治療并控制發(fā)作。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的CACNA1A基因c.4552G>A突變?yōu)閲鴥?nèi)首次報道的新突變，豐富了CACNA1A基因的突變譜，提高了臨床醫(yī)師對家族性偏癱型偏頭痛的認識，為FHM患兒的診斷和遺傳咨詢提供了重要線索。