吉莉莉，魏艷，何丹，陳雪玲，付婷婷，張崟，趙黎明

(1.成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106；2.華東理工大學(xué) 發(fā)酵工業(yè) 分離提取技術(shù)研發(fā)中心，生物反應(yīng)器工程重點實驗室，上海 200237)

聚乳酸(PLA)是以微生物發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸為單體聚合成的一類聚合物，有獨特的生物降解和生物相容性，在生物體內(nèi)可被水解成乳酸和乙酸，并經(jīng)機(jī)體內(nèi)酶代謝為二氧化碳和水[1-3]，代謝產(chǎn)物不會造成環(huán)境污染。近年來，聚乳酸材料在食品包裝材料、藥物、生物醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用廣泛[4-6]。天然的乳酸菌所產(chǎn)生的乳酸具有合成聚乳酸的潛力，更加保證了原料的天然性、安全性和環(huán)保性。

乳酸菌是發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢菌群，其主要作用是將肉制品中的糖類通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸，進(jìn)而使發(fā)酵肉制品的pH下降，起到抑制腐敗菌生長的作用[7-9]。鑒于乳酸菌為發(fā)酵香腸的優(yōu)勢菌種，我們從發(fā)酵香腸中分離鑒定出了3株乳酸菌。為了進(jìn)一步分析所得乳酸菌的產(chǎn)酸能力，本文對其產(chǎn)酸性能及生長特性進(jìn)行了研究。以期為工業(yè)化發(fā)酵制備乳酸，并將其用于聚乳酸類可降解材料的制備提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

試驗所用3株菌株均分離于實驗室四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸，分別為1號糞腸球菌(SIIA9047，Enterococcusfaecalis)、3號戊糖片球菌(SIIA9048，Pediococcuspentosaceus)和4號腸膜明串珠菌(SIIA9049，Leuconostocmesenteroides)。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich公司；MRS液體培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；氯化鈉、磷酸、氫氧化鈉：成都市科隆化學(xué)品有限公司；pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.1.3 主要試驗儀器與設(shè)備

UV-1100紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C-01酸度計 上海三信儀表廠；YX-1 SHDD手提式高壓滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；WPS-3000SL高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長曲線的繪制

將待測菌株以5.0 log CFU/mL分別接種于500 mL MRS培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度至5.0 log CFU/mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以 MRS 液體培養(yǎng)基為空白對照，每隔1 h在600 nm下測定菌液的OD值，繪制生長曲線。

1.2.2 產(chǎn)酸能力的測定

將待測菌株以5.0 log CFU/mL分別接種于250 mL MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，無菌取5 mL菌液，用酸度計測定菌液pH值，測10 d。

1.2.3 乳酸含量的測定

色譜分析條件：C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱溫：35 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；流動相：乙腈∶pH 2.0 磷酸溶液為2∶98(體積比)，配好后抽濾超聲脫氣待用[10]。

樣品處理：取培養(yǎng)0，12，24，48 h的菌液2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入70 mL水，在50 ℃的水浴中超聲20 min，冷卻至室溫，用水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，濾液裝入液相樣品瓶中待測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成8，2，0.5，0.125，0.0313，0.0078 g/L濃度的溶液，在高效液相色譜儀中進(jìn)行含量測定，并以峰面積-含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)基中乳酸含量。

1.2.4 耐鹽、耐亞硝酸鹽性能測定

將待測菌種以5.0 log CFU/mL分別接種于質(zhì)量濃度為0，2，4，6 g/dL NaCl及質(zhì)量濃度為0，5，10，15 mg/dL NaNO2的MRS培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基250 mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在600 nm下測定菌液OD值的變化。利用OD-乳酸菌數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出菌液濃度。

1.2.5 不同溫度下菌株的生長能力測定

將待測菌種以5.0 log CFU/mL分別接種于250 mL MRS培養(yǎng)基中，置于4，10，20，30，40 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，在600 nm下測定菌液OD值的變化。利用OD-乳酸菌數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出菌液濃度。

1.2.6 不同pH值下菌株的生長能力測定

將待測菌種以5.0 log CFU/mL分別接種于250 mL pH 2.5，4.5，5.5，6.5的MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在600 nm下測定菌液OD值的變化。利用OD-乳酸菌數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出菌液濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每個組設(shè)置3個重復(fù)組，所測得的數(shù)據(jù)經(jīng)過IBM SPSS Statistics 24分析，并以平均值±相對偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生長曲線的繪制

經(jīng)過0～24 h，每隔1 h對3株菌株的OD值進(jìn)行測定，繪制出3株菌的生長曲線，見圖1。

圖1 菌株生長曲線Fig.1 Growth curves of strains

由圖1可知，3號和4號菌的生長曲線呈現(xiàn)較強(qiáng)的生長能力，1號菌處于3株菌的最低水平，在8 h后3號和4號菌的生長速度顯著高于1號菌，3號和4號菌在18 h后趨于緩慢生長，生長曲線較平緩，1號菌從17 h后生長速度減緩，菌的OD值變化不大。由此可見，遲緩期1號菌為0～5 h，3號菌為0～2 h，4號菌為0～3 h；對數(shù)期1號菌為6～17 h，3號菌為3～18 h，4號菌為4～18 h；穩(wěn)定期1號菌為17 h后，3號菌為18 h后，4號菌也為18 h后，由于監(jiān)測時間有限，未檢測到乳酸菌的衰亡期。這與文獻(xiàn)[11]所檢測的青貯飼料中乳酸菌有所差異，可能是由于菌種不同所引起的。

2.2 菌株的產(chǎn)酸能力比較

圖2 菌株產(chǎn)乳酸量Fig.2 Quantity of lactic acid produced by lactic acid bacteria

圖3 菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.3 Acid production curves of lactic acid bacteria

由圖2和圖3可知，3株菌在培養(yǎng)初期 pH值的下降速度最為迅速，隨著時間的延長，趨勢逐漸變緩，到最后幾乎沒變化。3株菌在12 h內(nèi)產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在48 h內(nèi)1號菌產(chǎn)乳酸量持續(xù)增加，3號、4號菌則有所下降。結(jié)合3株菌的生長曲線，1號菌生長速度最慢，但產(chǎn)乳酸量最多，且第2天pH已經(jīng)降到4.0以下，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)；3號和4號菌產(chǎn)酸能力則弱于1號菌。Garriga認(rèn)為，在發(fā)酵肉制品中，產(chǎn)酸能力是篩選乳酸菌的一個重要指標(biāo)，發(fā)酵所產(chǎn)的乳酸使產(chǎn)品的pH下降，抑制腐敗菌的生長，提高產(chǎn)品安全[12]。乳酸菌產(chǎn)生的酸還能夠賦予發(fā)酵肉制品特征性的酸味[13]。而且，用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌，為了抑制病原菌，保證產(chǎn)品質(zhì)量，要求在24 h內(nèi)能使pH降到5.0以下[14]。在發(fā)酵肉制品中篩選乳酸產(chǎn)量高的乳酸菌，可以為聚乳酸提供更加安全的食品級原料，保證乳酸原料的安全與環(huán)保性。

2.3 菌株對NaCl的耐受性

菌株對不同質(zhì)量濃度NaCl的耐受性見表1。

表1 菌株對不同質(zhì)量濃度NaCl的耐受性Table 1 Tolerance of strains to different concentration of NaCl

注：表中數(shù)值為菌株在相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h所得發(fā)酵液中菌液濃度(log CFU/mL)。

由表1可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，3株菌的生長受到了不同程度的抑制，雖然還能繼續(xù)生長，但是鹽濃度越高，生長情況越差，說明這3株菌的生長受鹽含量的影響較大。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度增加到6 mg/dL時，3株菌的菌液濃度分別降低了43.14%、27.58%、38.32%，3號菌受到的影響最小，耐鹽性最好，4號次之。

2.4 菌株對NaNO2的耐受性

肉制品中常用NaNO2作防腐劑、發(fā)色劑。因此，肉制品發(fā)酵所用的菌株對NaNO2有一定的耐受性[15，16]。菌株對不同質(zhì)量濃度NaNO2的耐受性見表2。

表2 菌株對不同質(zhì)量濃度NaNO2的耐受性Table 2 Tolerance of strains to different concentration of NaNO2

注：表中數(shù)值為菌株在相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h所得發(fā)酵液中菌液濃度(log CFU/mL)。

由表2可知，3株菌均符合要求，隨著培養(yǎng)基中NaNO2添加量的增大，3株菌均受到了不同程度的影響。在NaNO2質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/dL時，3號和4號菌的生長情況較好，所受影響很小，對NaNO2的耐受性好，1號菌受到的影響最大，生長受到抑制，但也能生長，對NaNO2的耐受性較好。

2.5 菌株在不同溫度條件下的生長能力

菌株在不同溫度條件下的生長能力見圖4。

圖4 分離菌株在不同溫度下的生長能力Fig.4 Growth ability of isolated strains at different temperatures

發(fā)酵肉制品的發(fā)酵劑一般要求能在15～40 ℃條件下生長，低溫下也能有較強(qiáng)的生長能力，最適生長溫度范圍為30～37 ℃[17]。由圖4可知，1號和4號菌受溫度的影響比3號菌大，雖然不同的菌株受溫度的影響不同，但是3株菌的耐熱趨勢變化卻一致。在4,10,20 ℃條件下生長能力較弱，隨著溫度增加，菌株生長能力加強(qiáng)，在30 ℃時生長情況最好，溫度繼續(xù)增加，在40 ℃時，菌株的生長能力不及30 ℃時強(qiáng)，但比低溫情況下好，說明這3株菌的生長較耐高溫。

2.6 菌株在不同pH值條件下的生長能力

菌株在不同pH值條件下的生長能力見圖5。

圖5 分離菌株在不同pH值條件下的生長能力Fig.5 Growth ability of isolated strains at different pH values

肉制品發(fā)酵結(jié)束后，其pH值多低于5.3[18]，菌株能在酸性條件下生長。而隨著菌株生長，pH越來越低，是否能夠耐酸性條件生長對于乳酸產(chǎn)量影響非常重要。由圖5可知，在pH 3.5條件下，菌株均受到抑制，但能繼續(xù)生長，在pH 4.5時，菌株受到的抑制變小，尤其是4號菌，生長情況最好，pH繼續(xù)增大，1號和3號菌的生長情況明顯變好，但4號菌的生長情況卻不如在pH 4.5的條件下，可能是因為pH 4.5更接近于4號菌的最適生長pH。綜上，3株菌均能在pH 4.5的條件下較好地生長。

3 結(jié)論

由以上研究試驗可知，從發(fā)酵肉制品中分離得到的1號糞腸球菌(SIIA9047，Enterococcusfaecalis)、3號戊糖片球菌(SIIA9048，Pediococcuspentosaceus)和4號腸膜明串珠菌(SIIA9049，Leuconostocmesenteroides)均有較好的產(chǎn)乳酸能力，其中1號菌產(chǎn)生乳酸含量最高，在對鹽分及亞硝酸鹽耐受性上，3株菌各有優(yōu)勢。天然的乳酸菌產(chǎn)生的乳酸合成的聚乳酸更加保證了原料的天然性、安全性和環(huán)保性。聚乳酸作為近年來發(fā)展最迅速的可生物降解材料，在一次性餐飲行業(yè)的應(yīng)用上具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，正受到越來越多的關(guān)注。本研究結(jié)果為開發(fā)肉制品發(fā)酵劑和傳統(tǒng)肉制品加工以及工業(yè)化發(fā)酵制備乳酸并將其用于聚乳酸類可降解材料的制備提供了一定的依據(jù)。