錢靜亞，張 咪，孫文敬，代春華，霍書豪，馬海樂*

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

食品工業(yè)旨在為消費者提供高質(zhì)量、安全、營養(yǎng)的食品，因此需要對原材料到食品加工的各個環(huán)節(jié)進行控制，尤其是為了延長食品的貨架期，采用了諸如低溫保藏、氣調(diào)保藏等措施來保證食品質(zhì)量。但是，殺菌依然是保證食品安全最有效的方法之一[1]。熱殺菌雖然能很好地控制食品中的微生物，但會影響到食品的營養(yǎng)、風味等。而非熱殺菌，如超高壓（ultra-high pressure，UHP）殺菌、高壓CO2（high-pressure carbon dioxide，HPCD）殺菌、脈沖電場（pulsed electric fields，PEF）殺菌等能為消費者提供更高質(zhì)量的食品，因此成為食品殺菌的研究熱點。目前，對非熱殺菌機理的研究還處于探索階段，但蛋白質(zhì)組學的興起為從微生物蛋白質(zhì)動態(tài)變化的角度揭示非熱殺菌的機理提供了可能。

蛋白質(zhì)組學是研究一種細胞或一種生物表達的全部蛋白質(zhì)，主要研究蛋白的3 個生物學部分：蛋白的表達、結(jié)構(gòu)及其功能[2]。目前，二維電泳、質(zhì)譜、生物信息學等技術(shù)的結(jié)合是研究蛋白質(zhì)組學常用的方法。而同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）和串聯(lián)質(zhì)譜標簽（tandem mass tags，TMT）多肽體外標記定量技術(shù)的應(yīng)用更加完善了蛋白質(zhì)組學的研究手段。

蛋白質(zhì)組學技術(shù)的迅猛發(fā)展，使蛋白質(zhì)組學的研究成果日益豐富，也使蛋白質(zhì)組學的應(yīng)用領(lǐng)域得到了極大拓展。在微生物領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學已用于研究不同環(huán)境壓力，如低溫、高鹽、營養(yǎng)脅迫等對微生物細胞產(chǎn)生的影響以及微生物在這些脅迫條件下的應(yīng)激機制[3]。本文主要對蛋白質(zhì)組學在食品非熱殺菌致微生物失活中的應(yīng)用進行綜述。

1 蛋白質(zhì)組學在UHP殺菌中的應(yīng)用

UHP殺菌技術(shù)又被稱為高靜水壓處理技術(shù)，是一種很有前途的、可取代熱加工技術(shù)對食品中微生物進行處理的非熱加工技術(shù)[4-5]，它對食品的品質(zhì)，包括維生素含量、自然風味和質(zhì)地等影響較小[6]。這一技術(shù)已用于商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的一系列產(chǎn)品中，包括果汁、豆沙、蘸醬、果醬、色拉醬、牡蠣、即食肉制品等。

應(yīng)用于食品中的UHP壓力范圍一般在200～600 MPa之間[7]。由于在生物系統(tǒng)中發(fā)生的反應(yīng)太過復雜，因此在UHP滅活微生物時，無法很好地預(yù)測壓力對于特定微生物的影響，但是，一般認為高壓主要導致了蛋白質(zhì)變性，尤其是影響了具有催化功能的酶的活力，并造成了微生物細胞的破壞[8]。

采用蛋白組學方法研究UHP對菌體蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)UHP能夠影響細菌的結(jié)構(gòu)、應(yīng)激反應(yīng)以及代謝過程。UHP處理后，空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）、副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的蛋白表達量均出現(xiàn)一定的變化，結(jié)果如表1所示。

表 1 UHP對細菌蛋白表達量的影響Table 1 Effect of ultra-high pressure on protein expression in bacteria

1.1 UHP殺菌對細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達量的影響

300 MPa UHP處理空腸彎曲桿菌81-176后，與蛋白折疊相關(guān)的蛋白中有3 種蛋白（分子伴侶DnaK、觸發(fā)因子Tig、ATP依賴性蛋白酶HslU）的表達量上調(diào)，2 種蛋白（分子伴侶蛋白GrpE和熱休克蛋白HtpG）的表達量下調(diào)，在復蘇過程中DnaK和GrpE均未被恢復，DnaK參與蛋白的折疊、聚集、易位和絡(luò)合形成，以及在翻譯過程中與新生肽鏈的相互作用[9]?？漳c彎曲桿菌81-176中參與細胞膜合成的β-酮脂酰-酰基載體蛋白合成酶III（β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III，F(xiàn)abH）表達量上調(diào)，F(xiàn)abH酶催化乙酰輔酶A合成乙酰酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP），這是脂肪酸生物合成的第一步，而FabF酶表達量下調(diào)后又恢復，F(xiàn)abF酶參與不飽和乙酰ACP短鏈的延伸[9]。

對副溶血弧菌采用50、100、150、200、250 MPa進行UHP處理，發(fā)現(xiàn)所有與膜結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的蛋白隨著壓力升高被抑制，熱休克蛋白表達量在0～100 MPa壓力下上調(diào)，但在150～250 MPa處理壓力下下調(diào)[10]。

1.2 UHP對細胞應(yīng)激過程相關(guān)蛋白表達量的影響

空腸彎曲桿菌81-176在UHP滅菌后，涉及活性氧代謝的蛋白中有5 種蛋白的表達量上調(diào)，2 種蛋白的表達量下調(diào)，但在處理后1～2 h的復蘇過程中均被恢復[9]，氧化應(yīng)激誘導導致合成和分解代謝不平衡，產(chǎn)生活性氧，因此，壓力引起的細胞損傷在很大程度上與氧化損傷有關(guān)。

采用700 MPa的UHP對蠟樣芽孢桿菌處理30 min，超氧化物歧化酶表達量下降，超氧化物歧化酶是抗氧化脅迫作用中的關(guān)鍵酶，其中，UHP過程中錳過氧化歧化酶表達量的下降主要由活性菌代謝的下降和菌體死亡所引起[12]。因此，UHP可能減輕了微生物對氧化脅迫作用的應(yīng)激保護能力。此外，蠟樣芽孢桿菌的鞭毛蛋白在UHP處理前后的表達量變化最大。鞭毛蛋白與氧脅迫作用下的應(yīng)激保護機制相關(guān)[13]，鞭毛蛋白表達量的減少意味著蠟樣芽孢桿菌活力的下降導致了蠟樣芽孢桿菌毒力和應(yīng)對UHP脅迫作用的能力下降。

1.3 UHP對細胞代謝相關(guān)蛋白表達量的影響

UHP能夠影響細胞代謝過程，包括碳水化合物、氨基酸、核苷酸、能量代謝等。300 MPa UHP處理空腸彎曲桿菌81-176，與細胞代謝相關(guān)蛋白的表達量在處理后1～2 h的復蘇過程中發(fā)生了變化。其中，涉及能量和脂質(zhì)代謝的蛋白的表達量下調(diào)后在復蘇過程中恢復到原來的豐度，涉及糖類、氨基酸代謝的蛋白在復蘇過程中變化不一[9]。

1.4 細菌應(yīng)對UHP滅菌的可能機制

副溶血弧菌經(jīng)UHP滅菌后除了膜結(jié)構(gòu)與功能被抑制外，參與轉(zhuǎn)錄、翻譯的蛋白活力隨著壓力升高也被抑制，除基因ribH編碼的蛋白外，大多數(shù)與生物合成細胞過程相關(guān)蛋白的表達量也被下調(diào)。因此，副溶血弧菌可能通過抑制細胞膜的穩(wěn)定性和相應(yīng)功能（ω-3多不飽脂肪酸合成酶PfaC、丙氨酸消旋酶Alr2、糖基轉(zhuǎn)移酶MltA、磷脂酶PLA2和氨基酸ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運結(jié)合蛋白PatH）、減緩生物合成和細胞過程（L-天冬氨酸氧化酶NadB、天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶PyrB和乙酰谷氨酸激酶ArgB）、降低轉(zhuǎn)錄和翻譯水平（聚合酶σ因子RpoD）以及有效激活應(yīng)激要素（共同伴侶蛋白GroES、分子伴侶蛋白DnaK和GroEL）等來應(yīng)對UHP處理[10]。

2 蛋白質(zhì)組學在HPCD殺菌中的應(yīng)用

近年來，HPCD殺菌由于其環(huán)保性（CO2無毒）和低壓（一般低于20 MPa）等特點被認為是一種很好的非熱殺菌技術(shù)[14]。HPCD殺菌的機制可能與以下幾點相關(guān)：1）細胞內(nèi)外pH值的下降；2）細胞結(jié)構(gòu)的破壞，包括細胞膜完整性的破壞、胞內(nèi)或細胞膜關(guān)鍵成分的喪失等；3）分子CO2和HCO3-對細胞代謝的直接抑制作用，包括對關(guān)鍵酶的滅活作用；4）擾亂細胞內(nèi)的電解質(zhì)平衡。此外，Yan Wenjie等[15]認為HPCD降低了微生物細胞質(zhì)pH值，這種酸化誘導蛋白質(zhì)凝固變性，從而引起微生物失活。因此，HPCD致微生物失活的機理與蛋白的變化也存在一定的聯(lián)系。

2.1 HPCD殺菌對大腸桿菌細胞組成蛋白表達量的影響

參與細胞組成的蛋白主要包括脂蛋白突變體、外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）W和OmpA。10 MPa、37 ℃ HPCD處理大腸桿菌5～75 min后，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌脂蛋白突變體和OmpW表達量上調(diào)，OmpA表達量下調(diào)，這些變化說明HPCD破壞了大腸桿菌的細胞外膜[16]。

2.2 HPCD殺菌對大腸桿菌應(yīng)激調(diào)控蛋白表達量的影響

參與應(yīng)激調(diào)控的蛋白包括甘氨酰自由基輔因子、谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧環(huán)蛋白依賴巰基型過氧化物酶。HPCD處理后，大腸桿菌的甘氨酰自由基輔因子表達量下調(diào)、谷胱甘肽過氧化酶和硫氧環(huán)蛋白依賴巰基型過氧化物酶表達量上調(diào)[16]。

2.3 HPCD殺菌對大腸桿菌代謝相關(guān)蛋白表達量的影響

參與能量代謝的蛋白包括組氨酸ABC轉(zhuǎn)運蛋白、β-半乳糖苷酶、6-磷酸葡萄糖脫氨酶、谷胱甘肽ABC轉(zhuǎn)運蛋白。這4 種蛋白在HPCD處理后表達量上調(diào)，說明大腸桿菌通過加速能量代謝來適應(yīng)HPCD的脅迫[16]。

參與一般代謝的蛋白包括50S核糖體蛋白L10、谷氨酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)運亞基。HPCD處理后，50S核糖體蛋白L10表達量的下調(diào)可能與rRNA的合成同步發(fā)生，并間接控制了蛋白質(zhì)的合成，而谷氨酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)運亞基在HPCD處理后表達量出現(xiàn)上調(diào)[16]。

參與核苷酸代謝的蛋白涉及無機焦硫酸酶、饑餓過程中進行DNA保護的晶體結(jié)構(gòu)蛋白（DNA protection during starvation，Dps）以及饑餓誘導DNA結(jié)合蛋白。HPCD處理后，無機焦硫酸酶表達量上調(diào)，造成焦磷酸鹽積累，引起核酸合成的抑制；Dps表達量下調(diào)，饑餓誘導DNA結(jié)合蛋白表達量上調(diào)，這可能引起了DNA的變性[16]。上述3 種蛋白的差異表達非常復雜，可能會抑制核酸的合成和造成DNA損傷。

3 蛋白質(zhì)組學在超臨界CO2殺菌中的應(yīng)用

超臨界CO2技術(shù)能夠在相對適中的壓力（7.3～50 MPa）下使微生物失活[17]，存在于CO2臨界點（7.38 MPa和31.1 ℃）之外的超臨界CO2具有許多有利的特征，例如在微生物滅活時具有高溶解力、高擴散性和低黏度等[18]，且超臨界CO2無毒、不易燃、環(huán)保，對人和環(huán)境不產(chǎn)生負面效應(yīng)[19-20]。因此，超臨界CO2是一種非常具有吸引力的非熱加工技術(shù)。超臨界CO2的滅菌作用來自于多因素的組合，包括細胞質(zhì)的酸化、CO2陰離子濃度的提高、滲透脅迫、CO2萃取作用導致細胞膜通透性的增加和泄漏以及細胞的破裂等[21-23]。同時，Hossain等[24]發(fā)現(xiàn)超臨界CO2處理造成糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸桿菌、球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）等微生物細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解、酶活性喪失等，這可能也是造成細胞死亡的原因之一。

White等[25]采用雙向電泳分析超臨界CO2處理沙門氏菌中的蛋白，認為超臨界CO2殺菌處理不會影響到其蛋白的表達量，但Kim等[26]采用雙向電泳對超臨界CO2處理后的鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）中的蛋白質(zhì)組進行分析，發(fā)現(xiàn)超臨界CO2處理改變了鼠傷寒沙門氏菌與其細胞代謝相關(guān)的蛋白。在10 MPa、40 ℃條件下處理鼠傷寒沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)超臨界CO2處理后，33 個蛋白點表達差異較大，其中，11 個蛋白點的下調(diào)幅度超過50%。對這11 個蛋白點進行鑒定后發(fā)現(xiàn)這些蛋白都是參與細胞代謝途徑的酶類，分別為酮基-羥基戊二酸鹽醛縮酶、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、6-磷酸-N-乙酰-D-甘露糖胺異構(gòu)酶、脫氧核糖核酸醛縮酶、吡哆醇激酶、膽色素原脫氨酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、亞鐵螯合酶、胞苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脫水酶、分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫氫酶、硒代半胱氨酸裂解酶等，這些酶都與能量和蛋白的合成代謝相關(guān)[26]。例如，酮基-羥基戊二酸鹽醛縮酶催化磷酸戊糖途徑，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化AMP的補救合成途徑，3-磷酸甘油醛脫氫酶則參與糖酵解途徑。超臨界CO2處理后，微生物懸浮液的pH值下降，這可能是引起蛋白表達量變化的一個原因[27]?？傊R界CO2處理所引起蛋白質(zhì)水平的降低，會對微生物細胞的生存產(chǎn)生負面影響。

4 蛋白質(zhì)組學在PEF殺菌中的應(yīng)用

PEF殺菌技術(shù)是以較高的電場強度（10～50 kV/cm）、較短的脈沖寬度（0～100 μs）和較高的脈沖頻率（0～2 000 Hz）對液體、半固體食品進行處理，并且可以組成連續(xù)殺菌和無菌灌裝的生產(chǎn)線。

目前PEF對微生物的作用機理尚不完全清楚，通常認為PEF導致微生物細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生局部變化和破壞細胞膜滲透屏障[28-29]，這種效應(yīng)也被稱為電穿孔[30]，細胞膜的介電常數(shù)和電導率也會發(fā)生變化，與細胞質(zhì)和細胞外介質(zhì)的介電常數(shù)和電導率不同，造成空間電荷極化現(xiàn)象[31]。當微生物暴露于外加電場中時，電場會集中于細胞膜上，當跨膜電位到達臨界電壓0.2～1.0 V時，細胞膜就會出現(xiàn)瞬間的膜穿孔[32]，當穿孔出現(xiàn)不可逆時，細胞就會死亡。此外，PEF可能可以直接作用于蛋白和DNA分子，導致分子的破壞或變性[33]。Rivas等[34]在5 種入口溫度（7、16、24、30 ℃和38 ℃）下采用PEF處理大腸桿菌，在15 kV/cm、700 μs處理條件下，蛋白質(zhì)圖譜中7 個蛋白點發(fā)生明顯變化。

4.1 PEF殺菌對大腸桿菌結(jié)構(gòu)蛋白表達量的影響

在PEF入口溫度為7、16 ℃時，大腸桿菌OmpA的表達水平顯著降低（P＜0.05），在30、38 ℃時甚至從圖譜上消失；而其他6 種蛋白的表達量則顯著升高，包括高溫磷酸戊糖異構(gòu)酶GmhA、S14家族內(nèi)肽酶ClpA、核糖體蛋白S6、5’-三磷酸脫氧尿苷核苷酸水解酶Dut、鐵蛋白FtnA。這些蛋白都與PEF處理后微生物功能和結(jié)構(gòu)的恢復相關(guān)。對在24 ℃下PEF處理的大腸桿菌進行恢復，37 ℃恢復處理1 h后，有10 個蛋白點發(fā)生了變化，其中包括OmpA，其表達量較未恢復前提高了5.54 倍，這表明在細胞恢復過程中OmpA開始合成，這可能是為了恢復細胞外膜的完整性。Omp在細菌生理功能以及致病機制中發(fā)揮著多種作用[34]。采用相同條件（37 ℃、1 h）對38 ℃下PEF處理的大腸桿菌進行恢復處理后，屬于熱不穩(wěn)定延伸因子（elongation factor thermo unstable，Ef-Tu）的翻譯延伸因子Tu 2（Tufb）、位于細胞外膜上的金屬蛋白酶FtsH和Omp以及參與正確蛋白伸展的分子伴侶SurA的表達量增加[34]。

Omp主要位于細胞膜的外部并形成小孔，允許小分子出入細胞。蛋白質(zhì)組學的研究表明PEF部分或全部地破壞了Omp，因此，PEF以2 種方式影響著細胞和外部的交換：一是在細胞質(zhì)膜上產(chǎn)生孔洞，導致細胞內(nèi)代謝物損失；二是通過影響通道蛋白。

4.2 PEF殺菌對大腸桿菌代謝相關(guān)蛋白表達量的影響

對38 ℃下PEF處理的大腸桿菌進行恢復處理，DNA依賴型醛脫氫酶PutA、ATP酶、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，Sdh）A的表達量增加。DNA依賴型醛脫氫酶在以還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）形式消耗能量的過程中產(chǎn)生，對于有氧呼吸來說是不可少的；ATP酶也與呼吸作用相關(guān)，參與ATP的合成；SdhA參與三羧酸循環(huán)。而表達量下降的蛋白包括一些參與細胞代謝的蛋白，如參與半胱氨酸、天冬氨酸、色氨酸等氨基酸生物合成途徑的蛋白、參與糖代謝和糖異生途徑的磷酸甘油酸變位酶GmpI、涉及磷酸化作用和轉(zhuǎn)運葡萄糖到細胞內(nèi)以及到ABC轉(zhuǎn)運蛋白上的雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶PtgA[34]。

5 蛋白質(zhì)組學在脈沖磁場殺菌中的應(yīng)用

脈沖磁場（pulsed magnetic field，PMF）殺菌是將食品放置到產(chǎn)生PMF的線圈中進行處理，從而達到殺滅微生物的一種方法。PMF殺菌在常溫常壓下進行，可以克服熱殺菌對食品中熱敏性成分的破壞以及引起食品顏色變化等缺點，較好地保持食品中原有的營養(yǎng)成分和風味物質(zhì)。PMF主要通過改變微生物細胞的形態(tài)，破壞細胞壁和細胞膜，提高細胞膜滲透性并引起胞內(nèi)物質(zhì)外泄以達到細胞死亡的目的，同時，PMF也破壞了微生物的DNA[35]。

采用磁場強度3.3 T、脈沖數(shù)30的PMF對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）進行殺菌處理，比較殺菌前后枯草芽孢桿菌蛋白組發(fā)現(xiàn)存在19 種差異蛋白，有2 種蛋白在PMF處理后消失，1 種蛋白為新出現(xiàn)的，另外，有7 種蛋白的表達量上調(diào)，9 種蛋白的表達量下調(diào)[36]。

5.1 PMF殺菌對枯草芽孢桿菌細胞膜蛋白表達量的影響

經(jīng)PMF處理后消失的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，其中一種是胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白，胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白通常是革蘭氏陽性細菌內(nèi)的一種脂蛋白，它通過半胱氨酸N端連接到細胞膜上成為細胞膜的一部分，也可成為運輸系統(tǒng)的一個組成部分[37]。大多數(shù)原核生物的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)通過它來親和性地結(jié)合底物，并運送底物通過跨膜通道。在PMF處理后表達量下調(diào)的蛋白中有一種是OmpA，Omp表達量的下降說明PMF破壞了枯草芽孢桿菌的細胞膜[36]。

5.2 PMF殺菌對枯草芽孢桿菌代謝相關(guān)蛋白的影響

經(jīng)PMF處理后另一種消失的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定后為磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶是糖酵解過程中重要的酶之一，它將磷酸二羥丙酮催化成3-磷酸甘油醛后進入糖酵解途徑。PMF處理后，新出現(xiàn)的蛋白是一種功能未知的假設(shè)蛋白。在PMF處理后細胞分裂啟動因子、ATP酶β亞基、果糖二磷酸醛縮酶、底物結(jié)合蛋白、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶A和黃素蛋白酶WrbA的表達量上調(diào)；其中，果糖二磷酸醛縮酶在糖酵解途徑中催化1,6-二磷酸果糖形成3-磷酸甘油醛及磷酸二羥丙酮。除OmpA之外，在PMF處理后表達量下調(diào)的蛋白還有延伸因子G、磷酸甘油激酶、順烏頭酸酶、糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)載體蛋白、Dps、半乳糖結(jié)合胞質(zhì)蛋白和3-磷酸甘油醛脫氫酶[36]。磷酸甘油激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，能催化產(chǎn)生ATP；順烏頭酸酶能夠催化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸經(jīng)順烏頭酸生成異檸檬酸的可逆性異構(gòu)化反應(yīng)[38]；3-磷酸甘油醛脫氫酶在糖酵解和糖異生過程中均起著重要作用，能夠催化3-磷酸甘油醛形成1,3-二磷酸甘油酸的可逆性反應(yīng)，糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)載體蛋白構(gòu)成糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，而糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)不僅能夠調(diào)節(jié)細菌對碳源優(yōu)先使用、參與細菌運輸和吸收通過細胞壁的一些碳水化合物、控制細胞運動的趨碳性，而且能夠調(diào)節(jié)其他代謝途徑[39]。

對差異蛋白進行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)PMF對枯草芽孢桿菌的細胞膜造成了破壞，同時對胞內(nèi)物質(zhì)合成、能量代謝等造成影響。而差異蛋白經(jīng)過KEGG代謝通路分析后，發(fā)現(xiàn)PMF對枯草芽孢桿菌有機物和能量的代謝均產(chǎn)生了重要影響。

6 蛋白質(zhì)組學在脈沖強光殺菌中的應(yīng)用

脈沖強光（pulsed light，PL）殺菌屬于非熱紫外殺菌技術(shù)，它利用波長在200～1 000 nm的光輻射在10-3～200 ms內(nèi)產(chǎn)生的能量進行殺菌，其光譜范圍包括200～400 nm的紫外光（ultraviolet，UV）、400～700 nm的可見光以及700～1 100 nm的紅外光，但殺菌作用主要是由200～290 nm范圍內(nèi)短波紫外線造成的DNA光損傷所引起[40]。此外，Cheigh等[41]發(fā)現(xiàn)PL處理后的單核細胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）和大腸桿菌O157:H7的細胞膜被明顯破壞，內(nèi)部成分出現(xiàn)丟失和泄漏到膜外。此外，PL殺菌也通過影響參與細菌應(yīng)激轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白來影響細菌存活率。PL殺菌對綠膿假單胞菌（Pesudomonas pyocyaneum）、糞腸球菌蛋白表達量的影響如表2所示。

表 2 PL殺菌對細菌蛋白表達量的影響Table 2 Effect of pulsed light on protein expression in bacteria

6.1 PL殺菌對細胞應(yīng)激蛋白表達量的影響

對采用0.2 J/cm2PL處理后的綠膿假單胞菌進行蛋白質(zhì)組學分析，在二維電泳圖譜上發(fā)現(xiàn)15 種表達出現(xiàn)差異的蛋白，進一步質(zhì)譜鑒定后發(fā)現(xiàn)調(diào)控的應(yīng)激蛋白包括熱休克蛋白YggG、保守假定蛋白IbpA、Dps[42]，其中YggG和IbpA的表達量上調(diào)，YggG與IbpA在氧化應(yīng)激及UV照射等條件下[44]均可被誘導；而Dps表達量下調(diào)，Dps參與氧化還原動態(tài)平衡，防止DNA的氧化損傷[45]。噬菌體相關(guān)蛋白包括噬菌體蛋白FIIR2和假定蛋白等，這些相關(guān)蛋白的表達量都發(fā)生上調(diào)，已有報道認為這些蛋白在不利條件如絲裂霉素或UV處理引起DNA損傷時開始表達[46]。

采用0.2 J/cm2PL處理綠膿假單胞菌后，與細胞運動相關(guān)的4型菌毛蛋白前體蛋白PilA和抽動運動蛋白PilH的表達量均下調(diào)[42]。PilA主要編碼4型菌毛蛋白亞基，參與抽動運動，并黏附在菌體表面上參與細胞膜的合成；PilH蛋白作為復雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分，對于4型菌毛的生物合成必不可少[47]。

同樣，采用0.5 J/cm2PL處理糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)4 種應(yīng)激蛋白受到調(diào)控，包括2 種冷休克家族蛋白、1 種應(yīng)激反應(yīng)蛋白Gls24和1 種Dps家族蛋白[43]。冷休克家族蛋白對DNA和RNA起到保護伴侶作用，參與各種細胞過程并在多種微生物的應(yīng)激適應(yīng)過程中起到重要作用[48]；Dps家族蛋白參與氧化還原平衡[45]，Dps蛋白與DNA以及結(jié)合DNA的蛋白相互作用，與內(nèi)核組織和微生物生存相關(guān)；除Dps蛋白表達量下調(diào)外，其他3 種蛋白表達量都上調(diào)。細胞分裂蛋白DivIVA是細胞分裂、染色體分離、細胞生長必需的蛋白[49]，DivIVA蛋白表達量上調(diào)，說明PL改變了糞腸球菌的細胞分裂。

6.2 PL殺菌對細胞代謝相關(guān)蛋白表達量的影響

采用0.2 J/cm2PL處理綠膿假單胞菌后，6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白α亞基的表達量下調(diào)，這2 種蛋白與能量和碳代謝相關(guān)[42]。采用0.5 J/cm2PL處理糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)涉及能量代謝的5 種蛋白的表達量都下調(diào)，分別為烯醇化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、6-磷酸果糖激酶、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶[43]。

6.3 PL殺菌對細胞轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白的影響

采用0.2 J/cm2PL處理后，綠膿假單胞菌中與轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白包括延伸因子Ef-Tu、翻譯起始抑制劑TdcF以及抑制蛋白DksA的表達量均發(fā)生變化，Ef-Tu表達量上調(diào)2 倍，而TdcF和DksA表達量則下調(diào)[43]。DksA是rRNA轉(zhuǎn)錄的負調(diào)節(jié)因子[50]，DksA缺失，DNA的復制就會停止，但這種停止與外源性DNA損傷無關(guān)，當然，DksA也能誘導DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)和補充主要的重組蛋白RecA[51]；由于特定底物為mRNA的核糖核酸內(nèi)切酶TdcF的表達量也發(fā)生下調(diào)，DksA表達量的下調(diào)則成為利于轉(zhuǎn)錄和翻譯過程分子機制的一部分。

采用0.5 J/cm2PL處理糞腸球菌，涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的蛋白有5 種，包括延伸因子Ef-Tu、Ef-Ts、GreA和30S核糖體蛋白S2、核糖體循環(huán)因子，這些蛋白的表達量都上調(diào)；Ef-Tu有利于氨酰-tRNA進入核糖體，而Ef-Ts是與Ef-Tu進行交換的鳥嘌呤核苷酸交換因子[52]；這些蛋白表達量的上調(diào)表明糞腸球菌通過提高轉(zhuǎn)錄和翻譯水平來應(yīng)對PL脅迫。

7 結(jié) 語

當微生物在外界環(huán)境因素改變后，其細胞膜、細胞壁等遭受不同程度的損傷，細胞能量、蛋白質(zhì)合成、碳水化合物、脂質(zhì)代謝等受到一定影響，同時，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯等細胞活動也受到影響。微生物在外界因素改變的情況下，傾向于啟動自身特殊的應(yīng)激系統(tǒng)，增加蛋白質(zhì)的合成用于保護細胞完整性，增加各種具有特殊功能蛋白質(zhì)的合成用于積極進行多種合成和分解代謝等生理活動，以積極應(yīng)對外界條件的改變，從而能夠在改變后的環(huán)境中生存和繁殖。因此，蛋白質(zhì)組學對微生物致死機制和應(yīng)激機制的研究具有重要意義。

采用蛋白組學方法研究非熱殺菌方式對微生物的影響，發(fā)現(xiàn)微生物的失活與微生物蛋白表達量的變化存在一定關(guān)系，這些表達量發(fā)生變化的蛋白與細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能、生物合成過程、能量代謝等有關(guān)。蛋白質(zhì)組學的結(jié)果證明HPCD、PEF、PMF等非熱殺菌方式破壞了微生物細胞的OmpA，進一步證明這些非熱殺菌方式破壞了微生物細胞膜；而UHP、HPCD非熱殺菌方式造成生物合成過程中相關(guān)酶的表達量下調(diào)，說明這些非熱殺菌方式抑制了微生物細胞的生物合成過程；超臨界CO2、PL等殺菌方式則減少了微生物細胞內(nèi)與能量代謝相關(guān)酶的表達，表明細胞通過限制能量消耗來應(yīng)對這些殺菌方式造成的脅迫；此外，一些應(yīng)激蛋白，如UHP中出現(xiàn)的熱休克蛋白、HPCD殺菌中出現(xiàn)的谷胱甘肽過氧化物酶、PEF殺菌中出現(xiàn)的鐵蛋白FtnA以及PL殺菌中出現(xiàn)的冷休克家族蛋白，它們在殺菌后的表達量均上調(diào)，說明微生物通過提高內(nèi)在應(yīng)激水平來減少外界壓力帶來的不利效應(yīng)。蛋白質(zhì)組學的應(yīng)用不僅為從分子生物學角度揭示非熱殺菌的機制奠定了基礎(chǔ)，也為非熱殺菌在工業(yè)化上的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。