王 靜，刁翠茹，王華麗，李 祥，汪名春，王 浩,*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心標(biāo)準(zhǔn)三部，北京 100022；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036）

糖尿病是常見(jiàn)的、有遺傳傾向的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，隨著人們生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐漸上升，且發(fā)病人群日趨年輕化，糖尿病作為21世紀(jì)全球最大的健康問(wèn)題之一，已成為僅次于癌癥和心血管疾病的第三大疾病。II型糖尿病是糖尿病的主要形式，在高收入國(guó)家中II型糖尿病患者占糖尿病總患者87%～91%[1]。餐后高血糖濃度是II型糖尿病及其并發(fā)癥的主要特征之一，可通過(guò)抑制碳水化合物的吸收來(lái)控制。一些抗糖尿病藥物，如阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，通過(guò)抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性發(fā)揮作用，其雖然有效地抑制了餐后血糖濃度的上升，但持續(xù)使用往往伴隨著不良的副作用，如脹氣、腹部不適、惡心、嘔吐、腸鳴及腹瀉等，且機(jī)體的藥物耐受性也會(huì)逐漸增強(qiáng)[2]。因此，從天然產(chǎn)物中篩選獲得更安全、高效的抑制劑，成為II型糖尿病治療的研究熱點(diǎn)。迄今為止，已有大量的研究報(bào)道了各種植物提取物通過(guò)抑制碳水化合物水解酶的活性來(lái)達(dá)到抗糖尿病的目的[3-4]。因此尋找天然的無(wú)副作用的α-淀粉酶抑制劑至關(guān)重要。

鼠尾草酸是一種從迷迭香中提取的油溶性多酚類雙萜化合物（圖l），具有高效、安全無(wú)毒、耐高溫等特性[5]。Ninomiya等發(fā)現(xiàn)鼠尾草酸等迷迭香提取物除了可以通過(guò)有效調(diào)節(jié)脂肪的吸收來(lái)控制人體質(zhì)量從而達(dá)到減肥的目的外，還可以用于治療炎癥、消化不良、糖尿病等[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶具有良好的抑制作用[7]，但具體抑制機(jī)制尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)將針對(duì)鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制機(jī)制做進(jìn)一步的研究。主要從酶學(xué)動(dòng)力學(xué)、熒光猝滅以及分子模擬幾個(gè)方面研究鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制機(jī)理，以期為其在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供有益參考。

圖 1 鼠尾草酸結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of carnosic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠尾草酸（純度≥90%） 湖南先偉實(shí)業(yè)有限公司；豬胰腺α-淀粉酶 美國(guó)Sigma Aldrich公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；TP-114分析天平、UB-7 pH計(jì) 美國(guó)丹佛儀器有限公司；LF-1404019熒光光譜儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1α-淀粉酶活力的測(cè)定

α-淀粉酶活力測(cè)定根據(jù)Adisakwattana等的方法[8]略作改動(dòng)。100 μLα-淀粉酶液和50 μL不同質(zhì)量濃度的抑制劑，于37 ℃預(yù)孵化10 min。然后加入100 μL的底物（可溶性淀粉溶液）使反應(yīng)開(kāi)始，5 min后加入750 μL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴10 min后使反應(yīng)停止，取出后冰浴至室溫，取反應(yīng)液稀釋，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。

1.3.2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定參照李波等的方法進(jìn)行[9]。固定底物（可溶性淀粉）濃度，改變?chǔ)?淀粉酶質(zhì)量濃度，在不同α-淀粉酶質(zhì)量濃度條件下測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率，并對(duì)體系中的α-淀粉酶質(zhì)量濃度作圖，得到酶促反應(yīng)速率-酶質(zhì)量濃度曲線。固定α-淀粉酶質(zhì)量濃度，改變底物質(zhì)量濃度（[S]），確定鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶抑制的動(dòng)力學(xué)類型。

1.3.3 熒光光譜測(cè)定

使用LF-1404019熒光光譜儀分析α-淀粉酶與鼠尾草酸的相互作用。用0.1 mg/mL的酶液與不同質(zhì)量濃度（0、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL）的鼠尾草酸混合，在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合物的熒光強(qiáng)度。發(fā)射波長(zhǎng)為300～450 nm，狹縫寬度為10 nm，掃描速率為960 nm/min[10-11]。

1.3.4 分子對(duì)接分析

采用分子對(duì)接模擬的方法預(yù)測(cè)鼠尾草酸與α-淀粉酶的結(jié)合模式和作用力[12]。α-淀粉酶蛋白結(jié)構(gòu)從RCSB Protein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb）獲取，鼠尾草酸三維分子晶體由Sybylh1.1軟件畫出。在對(duì)接之前，鼠尾草酸配體與α-淀粉酶蛋白受體使用Discovery studio 3.5軟件的“Prepare Ligand tool”和“Prepare Protein tool”模塊默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行處理，從消化酶晶體結(jié)構(gòu)中去除水分子。用AutoDock 4.2分子模擬軟件對(duì)淀粉酶結(jié)合位點(diǎn)上的抑制配體進(jìn)行自動(dòng)分子對(duì)接研究[14]。本研究使用DS3.5軟件的CDOCKER進(jìn)行酶蛋白與小分子的分子對(duì)接操作，并使用下列參數(shù)：Top Hits-10、Random Conformations-10、Orientations to Refine-10、Force field-CHARMm和Use Full Potential-False。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖與方程擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制可以通過(guò)半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）來(lái)體現(xiàn)，即鼠尾草酸引起的α-淀粉酶活力損失50%的結(jié)果。以鼠尾草酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線[15]，結(jié)果如圖2所示，隨著鼠尾草酸質(zhì)量濃度的增加，鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶活力的抑制呈明顯的質(zhì)量濃度依賴性。

你是否經(jīng)常遇到這樣的情況：快遞送貨到家，自己卻在單位上班無(wú)法簽收，或是快遞已到樓下，而自己5分鐘前已飛奔在路上。這樣的尷尬場(chǎng)景在有了速遞易、豐巢柜等快遞柜后有了很大改善。

圖 2 阿卡波糖和鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制活性Fig. 2 Inhibitory effect of acarbose and carnosic acid on α-amylase activity

抑制劑的IC50取決于酶的活力和來(lái)源、底物類型和濃度以及其他實(shí)驗(yàn)條件（如反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值等）[16-18]。本實(shí)驗(yàn)采用pH 5.6作為α-淀粉酶的反應(yīng)條件，研究鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的活力的抑制作用。通過(guò)線性擬合計(jì)算出鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的IC50為1.12 mg/mL，與陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖（IC50＝0.089 mg/mL）相比，鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶活性的抑制效果略低，但依然具有較強(qiáng)的抑制作用，可能作為潛在的α-淀粉酶抑制劑。

2.2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 鼠尾草酸的可逆與不可逆抑制

固定底物的濃度，在不同鼠尾草酸質(zhì)量濃度（0、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL）條件下測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率，以α-淀粉酶的質(zhì)量濃度為變量并對(duì)其作圖[19]，得到的酶促反應(yīng)速率-酶質(zhì)量濃度曲線通過(guò)原點(diǎn)，如圖3所示。根據(jù)抑制劑與酶的結(jié)合方式不同，抑制劑對(duì)酶的抑制類型分為可逆抑制和不可逆抑制：當(dāng)加入不可逆抑制劑時(shí)，速率直線不通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)，與Y軸有一正截距；當(dāng)加入可逆抑制劑時(shí)，速率直線通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)，斜率較不加抑制劑時(shí)低。由圖3可以看到，加入鼠尾草酸后的速率直線通過(guò)了坐標(biāo)原點(diǎn)，依此推測(cè)鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制為可逆性抑制。

圖 3 鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的可逆性抑制作用Fig. 3 Reversible inhibition of carnosic acid against α-amylase

2.2.2 鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

以可溶性淀粉作為底物分析鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。固定α-淀粉酶的質(zhì)量濃度，在不同鼠尾草酸質(zhì)量濃度（0、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL）下，改變底物的質(zhì)量濃度，測(cè)定不同底物質(zhì)量濃度下反應(yīng)體系的反應(yīng)速率，得到α-淀粉酶在有無(wú)鼠尾草酸存在時(shí)的Lineweaver-Burk曲線（圖4）。

圖 4 鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的雙倒數(shù)曲線Fig. 4 Lineweaver-Burk plots for the inhibition type of carnosic acid against α-amylase

Michaelis常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax由公式（1）計(jì)算得到。由表1可知，與無(wú)抑制劑相比，在添加鼠尾草酸后，α-淀粉酶催化可溶性淀粉的反應(yīng)方程中Km增大，而Vmax基本保持不變，因此推測(cè)鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制作用類型屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

式中：Km是當(dāng)酶反應(yīng)速率達(dá)最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Ki為抑制劑常數(shù)；[I]表示抑制劑的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；[S]表示底物質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V表示酶的反應(yīng)速率/（mol/（Lgmin））；Vmax表示最大反應(yīng)速率/（mol/（Lgmin））。

表 1 鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶抑制的Vmax和KmTable 1 Vmax and Km values of carnosic acid for inhibiting α-amylase

2.3 鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的熒光猝滅效應(yīng)

蛋白質(zhì)熒光主要來(lái)自色氨酸殘基，而α-淀粉酶分子含有至少16 個(gè)色氨酸殘基，因此淀粉酶色氨酸殘基的天然熒光強(qiáng)度及其變化值可直接反映蛋白質(zhì)本身和周圍環(huán)境的變化[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示（鼠尾草酸的質(zhì)量濃度從曲線a～j分別為0、0.062 5、0.125、0.175、0.25、0.35、0.5、0.8、1.0、2.0 mg/mL）。由熒光光譜中可以看出，隨著鼠尾草酸質(zhì)量濃度的增加，α-淀粉酶的熒光強(qiáng)度逐漸降低，熒光光譜發(fā)生明顯猝滅現(xiàn)象。熒光強(qiáng)度的降低表明，經(jīng)鼠尾草酸處理后會(huì)引起α-淀粉酶疏水鍵的斷裂，導(dǎo)致色氨酸等非極性氨基酸殘基暴露于極性環(huán)境中[21]。同時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)從348 nm到340 nm，有微弱的藍(lán)移，表明鼠尾草酸與α-淀粉酶相互作用導(dǎo)致色氨酸的極性變化和本征熒光強(qiáng)度的猝滅。

圖 5 不同質(zhì)量濃度的鼠尾草酸對(duì)淀粉酶熒光光譜的影響Fig. 5 Effect of different concentrations of carnosic acid on fluorescence spectrum of α-amylase

2.4 結(jié)合常數(shù)等相關(guān)參數(shù)的分析結(jié)果

式中：F0與F分別為未加入與加入猝滅劑后體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Kq為熒光猝滅速率常數(shù)；τ0是不存在猝滅劑時(shí)物質(zhì)的熒光平均壽命，一般生物大分子的熒光平均壽命為1h10-8s。

利用公式（2）對(duì)圖5中數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合計(jì)算，可得Kq為1.1h1011L/（molgs）。此Kq大于最大散射碰撞猝滅速率常數(shù)2h1010L/（molgs），因此進(jìn)一步確定鼠尾草酸猝滅α-淀粉酶的過(guò)程不是由分子碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過(guò)程[23]。

如果熒光劑與猝滅劑之間存在靜態(tài)猝滅，可根據(jù)雙對(duì)數(shù)回歸曲線（公式（3））計(jì)算出結(jié)合位點(diǎn)n。

式中：[P0]為α-淀粉酶的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Ka為熒光與猝滅劑的表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q0]為鼠尾草酸的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

將圖5中數(shù)據(jù)代入公式（3），經(jīng)線性擬合后計(jì)算可得n≈1.114 1（表2），說(shuō)明鼠尾草酸與α-淀粉酶所形成的復(fù)合物中二者的比例接近1∶1，暗示α-淀粉酶上可能只有一個(gè)鼠尾草酸結(jié)合位點(diǎn)。

表 2 鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的熒光參數(shù)Table 2 Fluorescence parameters of α-amylase in the presence of carnosic acid

2.5 分子對(duì)接分析結(jié)果

由上述研究可知，鼠尾草酸與α-淀粉酶發(fā)生可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，且鼠尾草酸與α-淀粉酶只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此可以推測(cè)鼠尾草酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在α-淀粉酶的活性中心。為了進(jìn)一步確定鼠尾草酸在α-淀粉酶上的結(jié)合情況，進(jìn)行了鼠尾草酸與α-淀粉酶的分子對(duì)接分析。結(jié)果如圖6所示。作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，鼠尾草酸可逆地結(jié)合到酶變構(gòu)位點(diǎn)上，擾亂了α-淀粉酶的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)，形成可逆的酶-抑制劑復(fù)合物，減少了底物與酶的結(jié)合。為進(jìn)一步查看鼠尾草酸與α-淀粉酶作用的微環(huán)境，列出了結(jié)合位點(diǎn)附近對(duì)結(jié)合作用貢獻(xiàn)較大的氨基酸殘基（圖6B），分別是Leu162、Gln63、Tyr62、Asp300、Gly306、Ser105、Ala198、His101、Tyr151、Val163、Ile235和Glu233，其中鼠尾草酸與Tyr151在空間上非?？拷?。鼠尾草酸通過(guò)結(jié)合到Tyr151附近的疏水腔，引起周圍氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致Tyr151周圍包埋度增加，空間結(jié)構(gòu)更加嚴(yán)密，從而表現(xiàn)出α-淀粉酶內(nèi)源熒光的猝滅變化。

圖 6 鼠尾草酸與α-淀粉酶的分子對(duì)接Fig. 6 Molecular docking model for carnosic acid with α-amylase

圖 7 α-淀粉酶與鼠尾草酸相互作用的相應(yīng)氨基酸殘基Fig. 7 Amino acid residues for interaction between α-amylase and carnosic acid

從圖7中可以看出，鼠尾草酸和α-淀粉酶之間形成了兩個(gè)氫鍵。鼠尾草酸苯環(huán)上酚羥基的一個(gè)氧原子與附近氨基酸殘基Glu233形成氫鍵，鼠尾草酸羧基上的氧原子與附近氨基酸殘基Tyr151形成氫鍵，從而提高了鼠尾草酸-酶蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性。Tyr151和Glu233為α-淀粉酶中催化活性中心的關(guān)鍵殘基，這意味著鼠尾草酸能夠與淀粉競(jìng)爭(zhēng)α-淀粉酶的活性區(qū)域及改變酶的結(jié)構(gòu)，并與活性中心殘基形成氫鍵，從而會(huì)導(dǎo)致α-淀粉酶的催化效率降低[24]，這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，也是鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制機(jī)理。

3 討 論

糖尿病是一種由高血糖引起的慢性疾病，高糖飲食會(huì)導(dǎo)致血糖水平迅猛上升。膳食淀粉水解是血液中葡萄糖的主要來(lái)源，α-淀粉酶是淀粉分解和腸道吸收的關(guān)鍵酶，能催化淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原和各種麥芽糊精的α-D-1,4-糖苷鏈，使其斷裂成較短的低聚糖，其他的淀粉酶也參與了淀粉的分解過(guò)程，但是α-淀粉酶的貢獻(xiàn)是這個(gè)過(guò)程開(kāi)始的先決條件[25]。抑制α-淀粉酶活性可以有效控制血糖濃度，是治療糖尿病的有效方法之一。α-淀粉酶抑制劑通過(guò)抑制α-淀粉酶的活性阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，從而降低血糖水平[26]。α-淀粉酶已經(jīng)作為治療糖尿病的一個(gè)靶點(diǎn)，用來(lái)控制碳水化合物的消化和低聚糖的吸收[27]。多酚類、黃酮類物質(zhì)如茶多酚、苦蕎提取物等作為α-淀粉酶的抑制劑已經(jīng)被廣泛研究[28-29]。鼠尾草酸作為一種脂溶性天然抗氧化劑應(yīng)用范圍廣泛，已用于油脂及含脂食品、生物醫(yī)藥、化工、化妝品和飼料等方面，除了可以延緩油脂或含油食品的氧化，提高食品的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)貯存時(shí)間外，還具有良好的生理和藥理活性[5]。從天然來(lái)源產(chǎn)物中尋找有效的α-淀粉酶抑制劑，對(duì)糖尿病的防治具有重要意義。

本研究探討了鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的抑制作用，并采用熒光光譜法和分子對(duì)接研究了兩者之間相互作用的機(jī)理。酶促動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示，鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶活性的抑制具有明顯的濃度依賴性，且鼠尾草酸以可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式與α-淀粉酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，這與Sheng Zhanwu等的研究結(jié)果[7]相一致。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和某些小分子發(fā)生反應(yīng)時(shí)，體系的熒光性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變[30]。α-淀粉酶最大吸收波長(zhǎng)在280 nm附近，主要由色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）側(cè)鏈的光吸收引起，其波長(zhǎng)或吸收強(qiáng)度變化可反映Trp和Tyr殘基所處微環(huán)境的改變。鼠尾草酸對(duì)α-淀粉酶的熒光譜圖結(jié)果顯示，隨著鼠尾草酸質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)α-淀粉酶的內(nèi)源性熒光猝滅程度越來(lái)越強(qiáng)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算可知，鼠尾草酸與α-淀粉酶之間存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性地與α-淀粉酶的活性中心結(jié)合，形成鼠尾草酸-α-淀粉酶復(fù)合物，從而抑制了α-淀粉酶的活性。同時(shí)，采用分子對(duì)接的方式模擬鼠尾草酸與α-淀粉酶的結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼠尾草酸與底物競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合在酶的活性中心。有研究表明鼠尾草酸是良好的供氫體，其苯環(huán)上含有兩個(gè)羥基，苯環(huán)上的電子離域作用使酚羥基容易發(fā)生離子化，氫鍵在鼠尾草酸與α-淀粉酶的結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮了有很大的作用[30]。鼠尾草酸通過(guò)與周圍氨基酸殘基發(fā)生相互作用，觸發(fā)變構(gòu)調(diào)節(jié)，使酶的構(gòu)象發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致α-淀粉酶催化活性降低。

綜上所述，鼠尾草酸能夠很好地抑制α-淀粉酶的活性，從而阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取。為鼠尾草酸深層次研發(fā)利用提供理論依據(jù)。迷迭香作為一種天然的綠色植物，含有大量的活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明，該類成分多數(shù)具有降血糖、抗氧化和心血管等方面作用，對(duì)其進(jìn)行深入研究，有望將其開(kāi)發(fā)成為新一代治療心腦血管系列疾病的藥物[31]。迷迭香提取物作為一種天然抗氧化劑，由于其安全、高效的抗氧化性和較好的熱穩(wěn)定性，具有巨大的應(yīng)用潛力。