劉文虎 袁江北 常晉霞

摘?要?腫瘤細(xì)胞對曲妥珠單抗耐藥是導(dǎo)致其化療失敗的主要原因。前期研究表明，在曲妥珠單抗耐藥胃癌細(xì)胞 （NCI N87/R） 中，轉(zhuǎn)錄因子GATA6與DNA的結(jié)合活性顯著增強(qiáng)，這與其耐藥是否有關(guān)尚不清楚。本研究以NCI N87/R為研究對象，采用Crispr/Cas9技術(shù)構(gòu)建GATA6敲除細(xì)胞系（NCI N87R/GATA6）。在此基礎(chǔ)上，基于Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析GATA6調(diào)控曲妥珠單抗耐藥的信號通路。蛋白樣品經(jīng)還原烷基化，F(xiàn)ASP酶切，肽段經(jīng)液相色譜分離，LC-MS/MS定量分析，通過差異倍數(shù)及t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)蛋白;采用WebGestalt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體分析，利用GeneAnalytics數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析。結(jié)果表明，敲除GATA6增強(qiáng)了曲妥珠單抗對NCI N87/R的抑制作用，降低其侵襲。采用質(zhì)譜定量檢測出5792種蛋白質(zhì)，其中305種在NCI N87R/GATA6細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，182種表達(dá)下調(diào)。通路富集分析顯示，線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、葡萄糖代謝、丙酮酸代謝及TCA 循環(huán)、Wnt/β-catenin降解通路在NCI N87R/GATA6細(xì)胞中顯著改變。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）表明，線粒體動力蛋白OPA1和DNM1L、凋亡蛋白Caspase-9、TCA 循環(huán)代謝酶SUCLG2和MDH1、糖原代謝酶PYGL在NCI N87R/GATA6中顯著改變，表明GATA6敲除導(dǎo)致NCI N87/R細(xì)胞線粒體功能障礙、能量代謝異常，進(jìn)而誘導(dǎo)其凋亡，提示抑制GATA6轉(zhuǎn)錄活性可能是逆轉(zhuǎn)胃癌曲妥珠單抗耐藥的有效途徑。

關(guān)鍵詞?曲妥珠單抗; 抗藥性; Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué); GATA結(jié)合蛋白-6; 信號通路

1?引 言

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有腫瘤中位居第五，死亡率居第三[1]?；熓钱?dāng)前胃癌治療的主要手段。近年來，隨著腫瘤生物學(xué)的快速發(fā)展及腫瘤分子標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)，靶向治療已成為胃癌治療的有效途徑。曲妥珠單抗是靶向人表皮生長因子受體-2 （Human epidermal growth factor receptor-2， HER-2）的抗體類藥物，通過拮抗HER-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，發(fā)揮抗腫瘤作用，為HER-2陽性乳腺癌、胃癌及胃食管交界癌靶向治療的經(jīng)典藥物[2，3]。雖然曲妥珠單抗的抗腫瘤機(jī)制明確，療效肯定，然而腫瘤細(xì)胞對其產(chǎn)生抗藥性已成為制約其治療效果的棘手問題。因此，探究曲妥珠單抗耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)耐藥靶標(biāo)，對提高胃癌化療有效性及敏感性具有重要意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)是以生命體全部蛋白質(zhì)為研究對象，對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，進(jìn)而揭示蛋白質(zhì)功能的學(xué)科。近年來，隨著高通量、高靈敏和快速掃描質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，結(jié)合微量蛋白質(zhì)分離技術(shù)，以質(zhì)譜為檢測手段的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了飛躍發(fā)展，并在生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[4，5]。

GATA結(jié)合蛋白6（GATA6）屬于GATA家族成員，包含2個鋅指結(jié)構(gòu)，通過與靶基因序列[（A/T）GATA（A/G）]結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖及分化。研究發(fā)現(xiàn)，GATA6異常表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移及惡性行為關(guān)系密切，且在不同腫瘤中具有組織特異性和功能多樣性，如在胰腺癌、結(jié)腸癌、食管癌中具有促癌作用[6～8]，而在卵巢癌、膠質(zhì)瘤中具有抑癌作用[9，10]。乳腺癌中GATA6通過上調(diào)slug的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]，而結(jié)腸癌中通過調(diào)節(jié)尿激酶纖溶酶原激活因子促進(jìn)腫瘤侵襲[7]。另有研究表明，GATA6通過上調(diào)自噬促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌對埃羅替尼耐藥[12]，通過抑制Wnt/β-catenin信號降低西妥昔單抗對結(jié)直腸癌耐藥[13]，提示GATA6異常表達(dá)與腫瘤耐藥有關(guān)，但GATA6是否調(diào)控胃癌細(xì)胞對曲妥珠單抗耐藥，尚不明確。

本研究組前期研究表明[14]，在曲妥珠單抗耐藥的NCI N87/R細(xì)胞中，GATA6與DNA的結(jié)合活性顯著增強(qiáng)，提示GATA6作為癌基因在曲妥珠單抗耐藥中具有重要作用。本研究以NCI N87/R細(xì)胞為研究對象，采用Crispr/Cas9構(gòu)建GATA6敲除細(xì)胞（NCI N87R/GATA6），探究GATA6敲除對NCI N87/R細(xì)胞曲妥珠單抗耐藥的影響，在此基礎(chǔ)上，基于Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析了GATA6調(diào)控胃癌細(xì)胞對曲妥珠單抗耐藥的信號通路及可能機(jī)制。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

LTQ-Orbitrap Velos Pro質(zhì)譜儀、Easy-nLC 2000 nano高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）; SONICS多功能超聲儀（美國Sonics公司）; GL-802B型真空泵（海門其林貝爾儀器公司）; 5810R真空濃縮儀（德國Eppendorf公司）; CKX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）; LRH-70生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器公司）; 小型Trans-Blot電泳轉(zhuǎn)印槽（美國伯樂生物公司）。

NCI N87和NCI N87/R細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院施明教授惠贈，NCI N87R/GATA6細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。注射用曲妥珠單抗（440 mg， S20060026， 羅氏制藥公司）; 胎牛血清（Fetal bovine serum， FBS，美國Gibco公司）; DMEM培養(yǎng)基、胰酶（美國Mediatech公司）; 雙抗（北京鈕英泰克生物有限公司）; 二硫蘇糖醇（Dithiothreitol， DTT）、吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid， IAA）、尿素、NaHCO3（美國Sigma公司）; 甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、蛋白酶抑制劑（美國Thermo Fisher公司）; Bradford蛋白濃度試劑盒（北京康為生物有限公司），一抗OPA1（67589）、DNM1L （5391）、Caspase-9（7237）和GAPDH（5174） （美國CST公司）; SUCLG2（ab96172）、MDH1（ab180152）和PYGL（ab198268） （英國Abcam公司）; 羊抗兔（或鼠）IgG二抗（碧云天生物技術(shù)公司）; Lipofectamine 2000 （美國Invitrogen公司）; BsmBI （美國NEB公司）; T4連接酶（日本TAKARA公司）; CCK-8 kit（日本同仁化學(xué)研究所）。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?細(xì)胞培養(yǎng)?細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)液（10% FBS和1%雙抗） 中，在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞2次傳代后用于實(shí)驗(yàn)。為保持細(xì)胞的耐藥性，NCI N87/R和NCI N87R/GATA6細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為80 μg/mL的曲妥珠單抗[13]。

2.2.2?gRNA及寡核苷酸鏈合成?依據(jù)網(wǎng)站http：//crispr.mit.edu設(shè)計GATA6的gRNA，在線選取得分最高的前兩個核苷酸序列，分別為： ①正向5'-CACCGGAGGCGGCGGCCGGACCCC-3'，反向3'-AAACGGGGTCCGGCCGCCGCCTCC-5'; ②正向5'-CACCGGCGGAGAGCGGGGCCCCGG-3'， 反向3'-AAACCCGGGGCCCCGCTCTCCGCC-5'。

2.2.3?Cas9-GATA6 gRNA載體構(gòu)建?使用BbsI酶切Cas9質(zhì)粒，gRNA靶序列與Cas9質(zhì)粒經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB-Amp平板上，取單克隆分析測序，確定gRNA載體構(gòu)建成功（Cas9-GATA6 gRNA）。

2.2.4?細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選

將2 μg Cas9-GATA6、6 μg gRNA、1 μg pMD 2.G和1.5 μg psPAX2混合質(zhì)粒及15 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別加入100 μL無血清無抗性培養(yǎng)基，室溫孵育10 min，共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞包裝慢病毒，并用特異靶向敲除綠色熒光蛋白的gRNA與pMD2.G、psPAX2共轉(zhuǎn)染作為對照，培養(yǎng)72 h后收集上清液，慢病毒液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，

80℃保存?zhèn)溆?。將NCI N87/R細(xì)胞按每孔105 Cell/mL接種于六孔板，培養(yǎng)至70%更換無血清培養(yǎng)液，慢病毒感染細(xì)胞，48 h后加入0.5 μg/mL嘌呤霉素處理細(xì)胞72 h，流式分選單細(xì)胞于96孔板中，擴(kuò)大培養(yǎng)，PCR初選（引物序列正向： 5'-TCCAGCGCGGGAGCCCT-3'， 反向： 5'-GCGCCGAAGGTCCGTGG-3'）， 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) （Western blot） 驗(yàn)證。

2.2.5?CCK-8檢測細(xì)胞增殖?對數(shù)期NCI N87、NCI N87/R和NCI N87R/GATA6細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔含細(xì)胞數(shù)約5000個，按文獻(xiàn)[15]的方法檢測細(xì)胞增殖能力。

2.2.6?Transwell檢測細(xì)胞侵襲?于Transwell小室的上室中加入200 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，將對數(shù)期NCI N87、NCI N87/R和NCI N87R/GATA6細(xì)胞分別重懸，按文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，每個樣本隨機(jī)選取6個視野拍照，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計分析。

2.2.7?Western blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)?提取NCI N87/R 和NCI N87R/GATA6細(xì)胞全蛋白質(zhì)，按文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕法轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體及顯影?？贵wOPA1、DNM1L、Caspase-9、SUCLG2、MDH1、PYGL和GAPDH按1∶1000稀釋，二抗按1∶5000稀釋。采用 Image J 進(jìn)行灰度值分析，GraphPad Prism 7.04進(jìn)行定量分析。

2.3?色譜及質(zhì)譜條件

2.3.1?色譜條件?Easy nLC 2000 nano高效液相色譜儀，使用反相C18分離柱（2 cm×100 μm×3 μm）和C18分析柱（15 cm×75 μm×3 μm， 美國Thermo Fisher公司）。液相色譜分離條件：流動相A為水（0.1%（V/V）甲酸），流動相B為乙腈（0.1%甲酸），梯度洗脫： 0～5 min，0～5% B; 6～90 min，6%～35% B; 91～110 min，36%～98% B; 111～120 min，2% B; 流速200 nL/min。

2.3.2?質(zhì)譜及其檢測參數(shù)?LTQ-Orbitrap Velos Pro型質(zhì)譜儀，電噴霧（Electrospray ionization， ESI）離子源，電壓為3.8 kV，毛細(xì)管溫度350℃，源加熱溫度300℃，鞘氣流速40 arbitrary units，輔助氣10 arbitrary unit; Orbitrap一級掃描質(zhì)荷比（m/z） 200～2000，分辨率30000，數(shù)據(jù)格式Profile，多級質(zhì)譜掃描分辨率7500，數(shù)據(jù)格式Centroid，多級碎裂模式為碰撞誘導(dǎo)解離，歸一化裂解能量為35%。離子掃描電荷數(shù)范圍+2～+6，排除同位素干擾峰，動態(tài)排除重復(fù)時間為10 s，重復(fù)次數(shù)為5，排除列表大小為50，排除時間為20 s，高、低排除質(zhì)量寬度為3.0 Da。

2.4?細(xì)胞全蛋白提取

收集細(xì)胞沉淀，使用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution， PBS）洗滌2次，加入8 mol/L尿素（含1%蛋白酶抑制劑），渦旋30 s，冰上裂解10 min，超聲2 min，12000 r/min離心15 min （4℃），取上清液， 用Bradford法測定蛋白濃度。

2.5?還原烷基化及FASP酶切[17]

用50 mmol/L NH4HCO3分別配制0.5 mol/L的DTT和IAA。取蛋白樣品100 μg，加入DTT（終濃度為20 mmol/L），混勻，56℃反應(yīng)30 min，冷卻后加入IAA（終濃度為50 mmol/L），混勻，室溫避光30 min，加入20 mmol/L DTT，室溫避光15 min，12000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入超濾管（MWCO 10 kD），12000 r/min 離心40 min，加入300 μL 50 mmol/L NH4HCO3，12000 r/min離心3次，每次40 min。加入50 μL 50 mmol/L NH4HCO3和5 μg 胰蛋白酶混合液，37℃孵育4 h，補(bǔ)加150 μL 50 mmol/L NH4HCO3和 5 μg胰蛋白酶，37℃酶切過夜，12000 r/min離心40 min，以300 μL水清洗1次，合并兩次洗脫液，減壓得肽段樣品。

2.6?肽段分離

肽段經(jīng)Waters 2695 HPLC分離，流動相A為水，流動相B為乙腈。洗脫梯度：0～34 min，0～98% B; 35 ～40 min，98% B。流速0.5 mL/min，按1 min/管收集肽段洗脫液，合并（方法為：① 1、6、11、16、21; ② 2、7、12、17、22; ③ 3、8、13、18、23; ④ 4、9、14、19、24; ⑤ 5、10、15、20、25; ⑥ 26～30; ⑦31～35; ⑧ 36～40），得到8個混合肽段組分，60℃減壓干燥，采用質(zhì)譜檢測。

2.7?肽段檢測、定量及差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選

肽段樣品經(jīng)0.1%甲酸復(fù)溶，12000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)高效液相色譜分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀在線檢測，搭載Mascot 2.3 搜索引擎的Proteome Discover 1.4搜庫，數(shù)據(jù)庫為美國國家生物信息技術(shù)中心人源Refseq蛋白質(zhì)序列庫。檢索參數(shù)：母離子質(zhì)量公差為20 ppm，子離子為0.5 Da。蛋白質(zhì)修飾：半胱氨酸脲甲基化（Carbamidomethylation）為固定修飾，蛋氨酸N-乙?；把趸∟-term acetylation， oxidation）為動態(tài)修飾，采用Percolator正/反庫匹配搜索，肽段水平錯誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate， FDR）設(shè)定小于1%。

使用數(shù)據(jù)依賴分析（Data dependence analysis， DDA）采集數(shù)據(jù)，基于強(qiáng)度定量法（Intensity based absolute quantification， iBAQ）進(jìn)行蛋白質(zhì)定量[18]，采用FOT（Fraction of total）表示蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化后的峰值，含義為每個蛋白質(zhì)的iBAQ除以樣本中全部蛋白的iBAQ （即FOT = iBAQ/∑iBAQ）[19]。為方便計算，F(xiàn)OT×105= iFOT。肽段篩選標(biāo)準(zhǔn)為：每個蛋白質(zhì)被檢測到的特異性肽段數(shù)≥1，Mascot≥20。采用差異倍數(shù)及雙樣本等方差假設(shè)t檢驗(yàn)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)篩選，規(guī)定若某蛋白的定量值在兩組樣本中的均值之比≥2或≤0.5，且滿足p<0.05，則此蛋白質(zhì)在兩組樣本中的表達(dá)具有差異。

3?結(jié)果與討論

3.1?NCI N87R/GATA6細(xì)胞構(gòu)建及評價

基于Crispr/Cas9構(gòu)建NCI N87R/GATA6細(xì)胞，Western blot及質(zhì)譜定量分析結(jié)果證實(shí)，GATA6在NCI N87/R細(xì)胞中被完全敲除，表明NCI N87R/GATA6細(xì)胞構(gòu)建成功（圖1A和1D，本研究中使用NCI N87R/GATA6 gRNA1細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NCI N87/R細(xì)胞的侵襲能力較NCI N87顯著增加（p=0.01），而敲除GATA6使NCI N87/R的侵襲潛能降低（p=0.04） （圖1B）; 進(jìn)一步采用CCK-8試劑盒檢測了曲妥珠單抗對NCI N87、NCI N87/R和NCI N87R/GATA6細(xì)胞的抑制作用，顯示曲妥珠單抗對NCI N87細(xì)胞抑制最強(qiáng)，NCI N87R/GATA6次之，而NCI N87/R最不敏感（圖1C），提示敲除GATA6增強(qiáng)了曲妥珠單抗對NCI N87/R細(xì)胞的抑制作用。

3.2?細(xì)胞全蛋白檢測及定量分析

為明確GATA6敲除對NCI N87/R細(xì)胞曲妥珠單抗耐藥的影響，采用Crispr/Cas9構(gòu)建NCI N87R/GATA6細(xì)胞，基于Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對兩組細(xì)胞的全蛋白定量分析，考察GATA6敲除對NCI N87/R細(xì)胞表達(dá)譜的影響，并采用生物信息學(xué)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)，探究GATA6調(diào)控曲妥珠單抗耐藥的信號通路及可能機(jī)制，實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示。

3.3?數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

對NCI N87/R和NCI N87R/GATA6細(xì)胞樣本分別進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，基于Spearman 方法進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，組內(nèi)各樣本的相關(guān)系數(shù)均大于0.90 （電子版文后支持信息圖S1），表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

3.4?蛋白表達(dá)譜輪廓分析

先分析了兩組樣本蛋白質(zhì)表達(dá)譜的整體變化，并采用主成分分析法（Principal compnent analysis， PCA）進(jìn)行輪廓辨析，得到樣品組內(nèi)、組間得分圖。

由圖3可知，NCI N87R和NCI N87R/GATA6對應(yīng)的樣本分別沿主成分1和主成分2 （Principal component， PC1和PC2）分開，且承載樣本信息的圈在組內(nèi)聚集良好， 而組間明顯偏離（圖3A）。從熱圖（圖3B）得知，組內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平相似，而組間差異較大，表明GATA6敲除對NCI N87R細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜產(chǎn)生了明顯影響。

3.5?蛋白質(zhì)鑒定及差異蛋白質(zhì)的篩選

為保證肽段定量的準(zhǔn)確性及鑒定蛋白的可靠性，將肽段水平的卡值設(shè)置為“Strict”，并在蛋白水平設(shè)置≤1% 的FDR，共鑒定到5792種蛋白質(zhì)，其中3792種蛋白在每組細(xì)胞的2個以上樣本中被定量測定，將這3792種蛋白質(zhì)用于生物信息學(xué)分析。為明確數(shù)據(jù)分布，對NCI N87/R和NCI N87 R/GATA6樣本中蛋白質(zhì)的變化倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）分析，即將NCI N87/R和NCI N87R/GATA6樣本3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)峰面積均值之比作為變化倍數(shù)，再進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)95%以上的蛋白質(zhì)在兩組樣本中的FC值（NCI N87/R/NCI N87R/GATA6）在2倍范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布（電子版文后支持信息圖S2A）。 因此，數(shù)據(jù)分析適合獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。進(jìn)一步根據(jù)顯著性水平及均值的變化倍數(shù)繪制了火山圖（電子版文后支持信息圖S2B）。規(guī)定若某蛋白質(zhì)在3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的均值在兩組樣本中的比值≥2或≤0.5，且p<0.05，則此蛋白質(zhì)在兩組樣本中的表達(dá)具有差異，上調(diào)蛋白在火山圖中對應(yīng)的點(diǎn)被標(biāo)注為紅色，下調(diào)蛋白對應(yīng)的點(diǎn)被標(biāo)注為藍(lán)色，除此以外的蛋白認(rèn)為在兩組樣本中的表達(dá)未發(fā)生顯著變化，被標(biāo)注為灰色。結(jié)果表明，487種蛋白在NCI N87R/GATA6中的表達(dá)發(fā)生了變化（p<0.05），其中上調(diào)305種，下調(diào)182種（電子版文后支持信息表S1），未顯著變化3305種（p>0.05）。

3.6?差異表達(dá)蛋白質(zhì)基因本體分析

通過WebGestalt （http：//bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/option.php）數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)蛋白質(zhì)從生物學(xué)過程（Biological process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular component，CC） 和分子功能（Molecular function，MF）方面進(jìn)行基因本體分析（電子版文后支持信息圖S3）。細(xì)胞成分中，表達(dá)上調(diào)的蛋白主要定位于線粒體基質(zhì)、線粒體內(nèi)膜及線粒體復(fù)合物，下調(diào)的蛋白主要定位在線粒體基質(zhì)、線粒體外膜及局部黏附; 分子功能方面，表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)為調(diào)節(jié)核苷及GTP連接，下調(diào)的蛋白主要參與調(diào)控激酶活性; 生物學(xué)過程方面，表達(dá)上調(diào)的蛋白主要參與調(diào)控中性粒細(xì)胞在免疫中的調(diào)節(jié)及代謝作用，而下調(diào)的蛋白在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號通路、細(xì)胞分化等方面具有重要作用。

3.7?通路富集分析

利用GeneAnalytics數(shù)據(jù)庫（https：//ga.genecards.org/）對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行通路分析，并用氣泡圖對前20個通路（p<1×10

3）可視化展示（圖4）。結(jié)果表明，丙酮酸代謝和TCA 循環(huán)（p=5.33×10

5）、細(xì)胞凋亡（p=4.19×10

5）、DNA損傷（p=2.42×10

5）、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)（p=3.56×10

5）、葡萄糖代謝（p=3.04×10

5）、 Wnt/β-catenin降解（p=6.18×10

5）通路顯示較小p值（相關(guān)蛋白定量見圖4B），提示GATA6敲除導(dǎo)致NCI N87/R細(xì)胞的多條通路發(fā)生改變。

采用Western blot檢測了OPA1、DNM1L、Cleaved caspase-9、SUCLG2、MDH1及PYGL的表達(dá)，以進(jìn)一步評價質(zhì)譜定量分析的結(jié)果。結(jié)果表明，上述蛋白在NCI N87/R和NCI N87R/GATA6細(xì)胞中的變化趨勢與質(zhì)譜定量分析結(jié)果一致（圖5）。

眾所周知，線粒體不僅對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，而且在調(diào)控細(xì)胞能量代謝、誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡過程中必不可少。線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與其內(nèi)外膜的融合及分裂過程密切相關(guān)[20，21]。生理情況下，線粒體膜融合與分裂之間存在動態(tài)平衡，但在DNA損傷、外界刺激或基因缺失時，上述平衡被打破，導(dǎo)致線粒體物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常[22]。作為線粒體內(nèi)膜融合調(diào)控基因，OPA1缺失或表達(dá)下調(diào)可引起線粒體融合能力降低，結(jié)構(gòu)呈片段化，也可以引起線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)嵴改變，而結(jié)構(gòu)嵴改變與線粒體誘導(dǎo)的凋亡直接相關(guān)[22，23]。另一方面，作為線粒體重要分裂調(diào)控基因，DNM1L對維持線粒體形態(tài)及功能至關(guān)重要，在凋亡早期，DNM1L從細(xì)胞質(zhì)募集到線粒體外膜，啟動線粒體分裂機(jī)制，當(dāng)DNM1L缺失或下調(diào)時，不僅線粒體分裂能力下降，而且其能量代謝異常，細(xì)胞凋亡啟動，且DNM1L的突變引起線粒體外膜延伸，形態(tài)改變[24]。結(jié)果顯示，NCI N87R/GATA6細(xì)胞中DNM1L表達(dá)上調(diào)，OPA1表達(dá)下調(diào)，且調(diào)控線粒體膜延伸相關(guān)蛋白（MRPS35、MRPL42、MRPL38、MPRL37、MRPL49、MRPL4、MRPS23、MRPS15、MRPL28和MRPL44）的表達(dá)發(fā)生變化，表明線粒體結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常。此外，NCI N87R/GATA6細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-4、Caspase-9）表達(dá)上調(diào)，而細(xì)胞周期蛋白（CDK4、CDK6、CDK16、CDK5、CDK2和CDK9）表達(dá)均下調(diào)。據(jù)此推斷，GATA6敲除導(dǎo)致NCI N87/R細(xì)胞線粒體功能障礙，能量代謝異常，DNA損傷，細(xì)胞周期阻滯，經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)NCI N87R/GATA6凋亡，這可能是GATA6敲除導(dǎo)致NCI N87/R細(xì)胞對曲妥珠單抗增敏的重要原因。

葡萄糖經(jīng)糖代謝途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，后者經(jīng)三羧酸循環(huán)（TCA cycle）產(chǎn)生ATP，因此，葡萄糖是腫瘤細(xì)胞獲取能量的直接來源。琥珀酰輔酶A連接酶2（SUCLG2）是催化琥珀酸合成琥珀酰輔酶A （Succinyl-CoA）的關(guān)鍵酶，后者經(jīng)琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶（SCOT）催化，將輔酶A轉(zhuǎn)移至乙酰乙酸，催化合成乙酰乙酰輔酶A （Acetoacetyl-CoA），而Acetoacetyl-CoA斷裂生成乙酰輔酶A （Acetyl-CoA）進(jìn)入TCA循環(huán)[25]。結(jié)果表明，GATA6敲除導(dǎo)致NCI N87R/GATA6細(xì)胞中SUCLG2表達(dá)下調(diào)，而低水平的SUCLG2使腫瘤細(xì)胞代謝受阻，ATP生成減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力降低。另一方面，作為糖代謝的關(guān)鍵酶，蘋果酸脫氫酶（MDH1）能夠催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，后者經(jīng)氧化轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP。結(jié)果顯示，GATA6敲除導(dǎo)致NCI N87R/GATA6細(xì)胞MDH1低表達(dá)，提示GATA6直接或間接影響了NCI N87R/GATA6細(xì)胞TCA循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致能量供應(yīng)失衡，細(xì)胞增殖受限。

糖原代謝是腫瘤細(xì)胞能量代謝的重要組成部分，需要多種酶的催化才能完成，其中肝型糖原磷酸化酶（PYGL）是催化糖原磷酸化生成1-磷酸葡萄糖（1-P-G）的限速酶，而1-P-G在磷酸葡萄糖變位酶（PGM-1）作用下轉(zhuǎn)變成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），后者既可以通過糖酵解途徑產(chǎn)生ATP，也可以進(jìn)入磷酸戊糖途徑產(chǎn)生NADPH及5-磷酸核糖，而且PYGL通過動員腫瘤細(xì)胞的糖原分解，引起腫瘤細(xì)胞的代謝內(nèi)環(huán)境改變，減少腫瘤細(xì)胞活性氧（Reactive oxygen species， ROS）聚集，抑制由ROS/p53/p21通路激活引起的衰老，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[26]。PYGL異常表達(dá)與腫瘤耐藥有關(guān)，抑制PYGL的活性，能夠促進(jìn)貝伐珠單抗的抗腫瘤效果[26]，且在胃癌多藥耐藥細(xì)胞珠EPG85257RDB中，PYGL表達(dá)上調(diào)，提示PYGL催化糖原分解與腫瘤耐藥有關(guān)[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除GATA6能夠降低NCI N87R/GATA6細(xì)胞PYGL的表達(dá)，推測GATA6可能通過調(diào)控PYGL降低NCI N87R/GATA6細(xì)胞的糖原代謝能力，進(jìn)而造成糖利用減少，能量供應(yīng)不足。綜上所述，GATA6在胃癌曲妥珠單抗耐藥中具有重要作用，其機(jī)制可能與線粒體功能異常，腫瘤細(xì)胞供能不足或代謝異常，進(jìn)而通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

此外，本研究組前期研究表明[15]，Wnt/β-catenin信號通路激活對胃癌曲妥珠單抗耐藥具有重要貢獻(xiàn)。本研究表明，GATA6敲除導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路降解蛋白表達(dá)上調(diào)（PSMB4、PSMA5、PSMA6、PSMB5、PSMD6和PSMB7），表明GATA6對Wnt/β-catenin通路具有抑制作用，提示GATA6是Wnt/β-catenin的轉(zhuǎn)錄抑制因子，這與文獻(xiàn)[13]報道一致。另外，CDK5、SMAD、NF-κB及NOTCH4通路在NCI N87R/GATA6細(xì)胞中顯著變化，提示GATA6還可能通過其它途徑參與調(diào)控NCI N87/R細(xì)胞對曲妥珠單抗耐藥，其機(jī)制有待后續(xù)探究。

4?結(jié) 論

采用Crispr/Cas9技術(shù)構(gòu)建了GATA6敲除胃癌細(xì)胞株NCI N87R/GATA6，探究了GATA6敲除對曲妥珠單抗耐藥的影響。基于Label free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析了GATA6參與調(diào)控NCI N87/R細(xì)胞的信號通路，結(jié)果顯示，敲除GATA6對耐藥細(xì)胞線粒體功能、凋亡、葡萄糖代謝、丙酮酸代謝和TCA 循環(huán)及Wnt/β-catenin通路產(chǎn)生影響。本研究為逆轉(zhuǎn)胃癌曲妥珠單抗耐藥治療提供了參考。

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Label-free Quantitative Proteomics for Investigation of Signaling

Pathways of GATA6 Regulating Trastuzumab

Resistance in Gastric Cancer Cells

LIU Wen-Hu1，2， YUAN Jiang-Bei4， CHANG Jin-Xia*3

1（Research Center of Molecular Metabolomics， Xiangya Hospital Central South University， Changsha 410008， China）

2（Department of Pharmacy， North Sichuan Medical College， Nanchong 637100， China）

3（School of Basic Medical Sciences， North Sichuan Medical College， Nanchong 637100， China）

4（School of Pharmaceutical Sciences and Innovative Drug Research Center， Chongqing University， Chongqing 401331， China）

Abstract?Trastuzumab resistance is one of the principal causes of failure in tumor chemotherapy. Previous studies show that the DNA-binding activity of GATA6， a transcription factor， has a remarkable enhancement in trastuzumab resistant gastric cancer cells （NCI N87/R）， while its correlation to resistance remains unclear. In this study， Crispr/Cas9 was employed to establish a GATA6 knock-out cell line （NCI N87R/GATA6）. The signaling pathways regulated by GATA6 and related to trastuzumab resistance were investigated based on label-free quantitative proteomics combined with bioinformatics. The extracted proteins were alkylated， and digested using filter aided sample preparation （FASP）， and the peptides were separated via high performance liquid chromatography and thereafter quantified by LC-MS/MS. Differentially expressed proteins were screened by fold change and student's t-test between NCI N87/R and NCI N87R/GATA6 cells. WebGestalt website was adopted for Gene ontology analysis， and GeneAnalytics was utilized for pathway enrichment analysis. The results demonstrated that GATA6 knock-out enhanced the antiproliferative effect of trastuzumab on NCI N87/R cells and suppressed their invasion ability. A total of 5792 proteins were quantified by LC-MS/MS， among which 305 proteins were up-regulated in NCI N87R/GATA6 cells while 182 ones down-regulated. Pathway enrichment analysis revealed that mitochondrial transport， apoptosis， DNA damage， glucose metabolism， pyruvate metabolism and TCA cycle and Wnt/β-catenin degradation pathways exhibited significant changes. Western blot manifested that the expression of mitochondrial dyneins OPA1 and DNM1L， apoptosis protein caspase-9， TCA metabolic enzymes SUCLG2 and MDH1， and glycogen metabolic enzyme PYGL changed significantly in NCI N87R/GATA6 cells， manifesting that GATA6 knock-out gave rise to mitochondrial dysfunction and abnormal energy metabolism， and therefore inducing the apoptosis of NCI N87R/GATA6 cells. The result implicated that inhibiting the transcriptional activity of GATA6 could be an effective strategy to reverse trastuzumab resistance in gastric cancer.

Keywords?Trastuzumab; Resistance; Label-free quantitative proteomics; Transcription factor GATA-6; Signaling pathway

（Received 17 October 2019; accepted 7 November 2019）

This work was supported by the Applied Basic Research Program of Science and Technology of Sichuan Province， China （No. 2019YJ0378）， the Project of Sichuan Province Education Department （No. 17ZB0170）， the Doctoral Program of North Sichuan Medical College （No. CBY17-QD05）， and the Program of Science and Technology of Nanchong， China （No. 18SXHZ0402）.