李亞輝，鄒丹丹，梁穎，王英，周劍忠，*，蒲青

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇南京210014；2.南京農業(yè)大學食品科學技術學院，江蘇南京210095；3.江蘇省農業(yè)科學院農產品安全與營養(yǎng)研究所，江蘇南京210014；4.青海昆侖河枸杞有限公司，青海海西816102）

枸杞（Lycium barbarum）是被子植物門茄科枸杞屬的一種多刺植物，枸杞主要有寧夏枸杞和中華枸杞[1]，主要分布于我國西北地區(qū)。枸杞果實含有枸杞多糖、甜菜堿、枸杞色素等，對人體有促進免疫、抗衰老、抗疲勞、抗輻射等功能，是藥食兩用植物，具有較高營養(yǎng)和藥用價值[2-3]。枸杞以干品流通，亦可進行深加工，目前，常見的枸杞深加工產品主要有枸杞果干、枸杞果汁和枸杞果酒等[4-5]。

枸杞果酒保留了枸杞自身的營養(yǎng)價值，便于人體吸收，是貧血、睡眠質量不佳等人群的最佳選擇[6-7]。目前，枸杞果酒的釀造主要是參照葡萄酒的釀造方法，其生產工藝尚未成熟，生產中還存在很多技術問題[8-10]，渾濁沉淀是枸杞果酒儲存過程中常見的問題，其大大影響了枸杞果酒的商品形象[11]，澄清穩(wěn)定處理是解決果酒渾濁沉淀的主要技術方法。澄清是指通過處理使果酒具有一定的澄清度，穩(wěn)定則是以澄清為基礎，通過處理使果酒保持已有澄清度，處于穩(wěn)定狀態(tài)再無新的渾濁沉淀生成[12-13]。目前對果酒的澄清處理方法有過濾、自然澄清、下膠和離心等，穩(wěn)定處理方法有冷處理、熱處理和添加穩(wěn)定劑等[14-15]。通過添加澄清劑對果酒進行下膠是目前應用最多的澄清方法，王英等優(yōu)化了殼聚糖對黑莓干紅的澄清處理條件[16]；夏其樂等研究了明膠對楊梅露酒澄清度的影響[17]；牛廣財?shù)葘Ρ攘嗽硗梁蜌ぞ厶菍ι臣频某吻遄饔眯Ч鸞18]；忻勝兵等研究了皂土-蛋清復合澄清劑對海紅果酒的澄清效果[19]。果酒不同所用澄清劑不同，其達到的澄清效果也不同。

本試驗在篩選出最佳澄清劑的基礎上，通過響應面優(yōu)化其澄清條件，同時對枸杞果酒的冷穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和微生物穩(wěn)定性進行研究，以期找到有效的澄清穩(wěn)定處理方法，為枸杞果酒生產提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞果酒：江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所釀制；殼聚糖：南通綠神生物工程有限公司；交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（crosslinking poly vinylpyrrolidone，PVPP）、皂土、0.45 μm 有機濾膜：上海杰兔工貿有限公司；明膠：漯河市五龍明膠有限公司；NaOH 標準溶液（0.01 mol/L）、I2標準溶液（0.05 mol/L）：深圳市博林達科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JA203 分析天平：天津市精拓儀器科技有限公司；WS 手持糖度計：北京測維光電儀器廠；UV-1100 分光光度計：上海美普達儀器廠；JA3003 精密電子天平：上海衡平儀器儀表廠；TGL-20M 冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；501A 水浴鍋：上海試驗儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果酒釀造工藝及要點

1.3.1.1 釀造工藝流程

枸杞果酒的釀造工藝流程如圖1 所示。

圖1 枸杞果酒釀造工藝流程Fig.1 Technological process of wolfberry wine

1.3.1.2 操作要點

1）制漿：取一定量的干制枸杞，加入其質量4 倍的水，浸泡40 min，再將其煮沸10 min，冷卻后打漿，得枸杞漿。

2）酶解：加入枸杞漿質量0.002%～0.005%的果膠酶，在 30 ℃～40 ℃酶解 2 h～3 h。

3）調配：調節(jié)果漿pH 值為4.5，加入蔗糖調整其糖度為20 Brix，加入偏重亞硫酸鉀150 mg/L 混勻。

4）酵母活化：稱果漿質量0.05%的釀酒酵母DV10，放入4%的葡萄糖水中在38 ℃下活化0.5 h～1 h。

5）發(fā)酵：將活化的酵母接入果漿、混勻，在25 ℃下發(fā)酵，每天攪拌一次，每天測其中的糖含量，待糖含量小于4 g/L 時，發(fā)酵停止。

6）過濾：用無菌紗布將枸杞酒中的大顆粒固體物質除去。

7）膜濾：將下膠處理后的枸杞酒用0.45 μm 有機膜過濾除菌。

1.3.2 枸杞果酒理化指標測定

總糖、總酸、酒精度、總SO2和游離SO2含量測定參照國標GB 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》所述方法；澄清度測定參照徐春等方法[20]，以蒸餾水為空白對照，以680 nm 下透光率表示澄清度。

以上每個樣品均重復3 次。

1.3.3 澄清劑及澄清條件優(yōu)化

1.3.3.1 澄清劑的配置

1%的明膠溶液、1%的殼聚糖溶液、皂土和PVPP溶液配置參照李亞輝等所述方法[21]。

1.3.3.2 澄清劑的選擇

分別以明膠、殼聚糖、PVPP 和皂土為澄清劑對枸杞果酒進行下膠，測定每種澄清劑不同下膠量對枸杞果酒澄清度的影響。下膠后20 ℃靜置10 d，取上清，測定其在680 nm 下透光率表示澄清度。試驗重復3 次結果取平均值。不同澄清劑添加量如表1 所示。

表1 澄清劑及其添加量Table 1 Clarifying agent and addition amount

1.3.3.3 澄清條件單因素試驗

根據(jù)澄清劑篩選結果，以澄清效果最好的皂土為澄清劑對枸杞果酒進行澄清處理。取一定量浸泡好的皂土在攪拌狀態(tài)下加入到0.5 L 枸杞酒中，使其混合均勻，在一定溫度下靜置一段時間，取上清液測其在680 nm 下透光率表示澄清度。按此方法分別研究了皂土用量、澄清時間和澄清溫度對枸杞酒澄清度的影響。單因素試驗設計及處理條件見表2。每個單因素試驗平行重復3 次，結果取平均值。

表2 單因素試驗設計Table 2 Experimental design for single factor

1.3.3.4 澄清條件的優(yōu)化

在單因素試驗結果基礎上，采用Box-Behnken 設計，以澄清度（680 nm 處透光率）為響應值，以皂土用量、澄清時間和澄清溫度為影響因素，以-1，0，+1 分別代表自變量的低、中、高3 個水平，利用響應面分析對其澄清條件進行優(yōu)化。響應面設計因素和水平表見表3。

表3 響應面設計因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 穩(wěn)定試驗

1.3.4.1 冷處理

枸杞果酒澄清處理后（按1.3.3 化條件進行）用0.45 μm 濾膜過濾、裝瓶，然后分別置于-4、0 ℃和 4 ℃恒溫冰箱中靜置10 d，以置于常溫下樣品為對照，取出樣品依次在 40、30、20、10、0 ℃各放置 1 周后，觀察樣品是否有渾濁沉淀，并測定其在680 nm 處的透光率表示澄清度。

1.3.4.2 熱穩(wěn)定性檢驗

將新釀造的枸杞果酒分別做如下處理：

對照：膜濾，裝瓶。

處理1：裝瓶加熱煮沸20 min，冷卻，膜濾，裝瓶。

處理2：下膠澄清（按1.3.3 化條件進行），膜濾，裝瓶。

處理：3：裝瓶加熱煮沸20 min，冷卻，下膠澄清（按1.3.3 優(yōu)化條件進行），膜濾，裝瓶。

將對照及處理加熱煮沸20 min 后常溫靜置7 d，觀察酒體外觀，并測定其在680 nm 處的透光率表示澄清度。

1.3.4.3 微生物穩(wěn)定性檢驗

將澄清處理的枸杞果酒（按1.3.3 優(yōu)化條件進行澄清處理）裝瓶后，在水浴中分別加熱至中心溫度為60、70、80、90 ℃并保溫 20 min，以未進行熱處理的為對照，冷卻后在常溫下放置7 d，然后分別取樣、平板劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h，記錄平板上的菌落總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS18.0 和Design Expert V8.0 數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 枸杞果酒理化指標

枸杞果酒理化指標測定結果如表4 所示。

表4 枸杞果酒理化指標Table 4 Physical and chemical indicators of wolfberry wine

由表4 可知，總糖含量3.85 g/L 達到了干型酒的標準，總SO2含量64.24 mg/L，遠遠低于250 mg/L 的國家標準，游離SO2含量約為總SO2含量的2/3，澄清度較低為78.3%。

2.2 澄清劑及澄清條件優(yōu)化

2.2.1 澄清劑選擇

不同澄清劑對枸杞果酒的澄清效果如圖2 所示。

圖2 不同澄清劑對枸杞果酒的澄清效果Fig.2 Clarification effect of different clarifying agents on wolfberry wine

明膠作為果酒常用澄清劑，可與酒中單寧結合并吸附其他雜質形成沉淀[22]。由圖2 可知，明膠添加量為0.04 g/L 時，澄清效果最佳。然后隨著添加量增加，澄清度逐漸下降，可能是由于酒中單寧含量過少，過多明膠對酒中膠體物產生保護作用，導致澄清度下降。殼聚糖具有良好的絮凝效果，可使酒中小顆粒懸浮物聚集并沉淀，從而使酒達到澄清的效果[23]。由圖2 可知，當殼聚糖添加量為0.3 g/L～0.4 g/L 時澄清效果最好，當大于此添加量時，澄清度逐漸下降。這可能是因為殼聚糖本身有較強的黏性，過多添加時，使酒體形成一種穩(wěn)定的體系，不利于果酒的澄清。PVPP 對酒中多余的酚類物質和可溶性蛋白有較強的吸附力[24]。由圖2 可看出，在一定用量范圍內PVPP 可提高枸杞果酒的澄清度，添加量為0.3 g/L 時澄清度最高，繼續(xù)加入，澄清度開始降低。皂土也為果酒常用澄清劑，其吸水后膨脹變得疏松多孔，形成帶負電荷的膠體，可與酒中帶正電荷的渾濁物絮凝成沉淀，從而使果酒澄清[24]。由圖2 可知，在低添加量時澄清度隨皂土用量的增加而升高，添加量為0.6 g/L 時澄清度最高，然后隨著添加量的增加澄清度幾乎沒有變化。整體來看，4 種澄清劑都能不同程度的提高果酒澄清度，其中以皂土效果最好，且皂土價格便宜，因此選擇皂土作為枸杞果酒的最佳澄清劑。

2.2.2 澄清條件單因素試驗

皂土用量、澄清時間和澄清溫度對枸杞酒澄清度的影響分別如圖3、圖4 和圖5 所示。

圖3 皂土添加量對枸杞酒澄清度的影響Fig.3 Effect of bentonite amount on clarity of wolfberry wine

圖4 澄清時間對枸杞酒澄清度的影響Fig.4 Effect of clarification time on clarity of wolfberry wine

圖5 澄清溫度對枸杞酒澄清度和色度的影響Fig.5 Effect of clarification temperature on clarity of wolfberry wine

皂土是鋁的自然硅酸鹽，可固定水而明顯增加自身體積，在電解質溶液中可吸附蛋白質和色素而產生膠體的凝聚作用，因此皂土可用于果酒的澄清處理。由圖3 可知，澄清度隨著皂土添加量的增加逐漸升高，添加量為0.6 g/L 時澄清度最高，然后隨著添加量增加澄清度逐漸下降。由圖4 可知，澄清時間至少達到10 d時才能具有較高澄清度，繼續(xù)延長澄清時間對澄清度沒有顯著影響。由圖5 可知，在10 ℃到20 ℃溫度范圍內進行澄清處理可達到較高澄清度，大于20 ℃時澄清度開始明顯降低。由圖3～圖5 結果可看出：皂土用量、澄清時間和澄清溫度對枸杞酒澄清度都有不同程度的影響；考慮到時間成本和溫控成本，選擇最佳澄清時間為10 d，選擇最佳澄清溫度為20 ℃。

2.2.3 澄清條件優(yōu)化

2.2.3.1 數(shù)學模型建立及方差分析

根據(jù)單因素試驗結果，以皂土用量（A）、澄清時間（B）和澄清溫度（C）為影響因素，以澄清度（Y）為響應值，設計三因素三水平響應面試驗，Box-Behnken 試驗結果見表5。

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of response surface methodology

采用Design-Expert V8.0.6.1 軟件對試驗結果進行多元回歸擬合，得到澄清度的二次多項回歸模擬方程如下：Y=91.8+1.63A-0.36B-1.26C-0.33AB-0.43AC-0.85BC-4.6A2-1.43B2-1.67C2。

用Design-Expert V8.0.6.1 軟件對表5 進行回歸模型方差分析，結果見表6。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the response surface model

由表6 可知：A 和C 對澄清度有極顯著影響（P＜0.01），而 B 對澄清度無顯著影響（P＞0.05）。這說明皂土用量和澄清溫度是澄清度的主要影響因素，澄清時間對其影響較小。二次項 A2、C2極顯著（P<0.01），B2不顯著（P＞0.05），交互項 BC 極顯著（P<0.01）。響應面建立的二次回歸模型極顯著（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05）；該模型R2=0.991 0、校正決定系數(shù)=0.979 3，表明該模型預測值與試驗值有較好的擬合度，說明可用此模型分析枸杞果酒的最佳澄清條件。

2.2.3.2 響應面分析及優(yōu)化

皂土用量、澄清時間和澄清溫度相互交互作用對枸杞果酒澄清度的影響如圖6～圖8 所示。

圖6 皂土用量和澄清時間對澄清度的影響Fig.6 Effects of bentonite amount and bentonite treatment time on clarity

圖7 皂土用量和澄清溫度對澄清度的影響Fig.7 Effects of bentonite amount and bentonite treatment temperature on clarity

由圖6、圖7 和圖8 可知，任何兩個交互因素的響應面都存在最高點，其中澄清時間和澄清溫度的交互作用影響比較明顯。通過Design-Expert V8.0.6.1 軟件分析優(yōu)化得到，獲得最高澄清度時的最佳澄清條件是皂土用量0.64 g/L，澄清時間9.2 d，澄清溫度20.5 ℃，在此條件下枸杞果酒的澄清度為92.8%。為了驗證所得方程可行性，對所得最佳澄清條件進行了驗證試驗。在皂土用量、澄清時間和澄清溫度分別為0.6 g/L、9 d 和20 ℃下進行3 次平行試驗，所得澄清度（91.3±0.21）%，與預測值的相對誤差為1.62%，說明優(yōu)化結果可靠。

圖8 澄清時間和澄清溫度對澄清度的影響Fig.8 Effects of bentonite treatment time and treatment temperature on clarity

2.3 穩(wěn)定試驗

2.3.1 冷處理

冷穩(wěn)定試驗結果如表7 所示。

表7 冷處理試驗結果Table 7 Result of cool treatment

冷處理是指使酒在低溫下放置一定時間，冷處理可使酒體達到穩(wěn)定狀態(tài)保持較好澄清度。由表7 可知，在不同溫度放置后對照酒體渾濁且有沉淀產生，澄清度大大降低，說明未進行冷處理的酒體穩(wěn)定性差，不能較好的保持原有澄清度。-4 ℃處理的樣品穩(wěn)定性較好，在不同溫度下放置后酒體仍澄清透亮，依然保持較高澄清度；其次是0 ℃處理的樣品；4 ℃處理的樣品有渾濁產生，澄清度有明顯降低。

2.3.2 熱穩(wěn)定性檢驗

對于甜型和半甜型果酒加熱殺菌是生產中必要的步驟。果酒中含有大量蛋白質、色素和多酚等熱敏性物質，加熱后往往產生渾濁沉淀[25]。本試驗對枸杞果酒進行不同處理后，檢驗其熱穩(wěn)定性，結果如表8所示。

由表8 可知，對照加熱后酒體渾濁且產生大量絮狀沉淀，澄清度顯著降低，說明枸杞果酒熱穩(wěn)定性較差；處理1 加熱處理和處理2 下膠處理可從一定程度上緩解枸杞酒的熱不穩(wěn)定性，但加熱后仍有渾濁沉淀產生，且澄清度下降，說明仍然存在熱不穩(wěn)定性；處理3 在加熱處理基礎上進行下膠處理，加熱后酒體澄清透亮且具有較高澄清度，說明經此處理后枸杞果酒具有較好的熱穩(wěn)定性。

表8 熱穩(wěn)定性檢驗Table 8 Result of thermal stabilization

2.3.3 微生物穩(wěn)定性檢驗

枸杞果酒微生物穩(wěn)定性檢驗結果如圖9 所示。

圖9 微生物穩(wěn)定性檢驗Fig.9 Result of microbial stabilization

對于部分低酒精度果酒和甜型、半甜型果酒，為保證其微生物安全性，加熱殺菌是必要步驟[26]。由圖9可知，未進行殺菌的對照組有較高的菌落總數(shù)；在60 ℃和70 ℃溫度下處理后，菌落總數(shù)有顯著降低，但未完全達到無菌狀態(tài)；在80 ℃和90 ℃溫度下處理后，菌落總數(shù)為0，可達到較好的微生物穩(wěn)定性?？紤]到經濟成本和過高溫度對酒品質的影響，因此選擇最佳殺菌溫度為80 ℃。

3 結論

本文以澄清度為指標，對枸杞果酒的澄清劑選擇、澄清處理和穩(wěn)定處理方法進行了研究。結果表明：皂土下膠可獲得較高澄清度，為枸杞果酒最佳澄清劑；利用皂土澄清的最佳條件為，皂土添加量0.6 g/L、澄清時間9 d、澄清溫度20 ℃，在此條件下，枸杞果酒的澄清度為91.3%；在-4 ℃下處理10 d 可使枸杞果酒獲得較好的穩(wěn)定性，瓶儲中保持較高的澄清度，無渾濁沉淀產生；加熱處理后進行下膠處理，可使枸杞果酒獲得較好的熱穩(wěn)定性；80 ℃殺菌20 min 可使枸杞果酒達到較好的微生物穩(wěn)定性。