翟晶巖 劉長興

血管內(nèi)置管是住院患者處置中重要的一項手段，尤其在重癥加強(qiáng)護(hù)理病房(Intensive care unit,ICU)中，根據(jù)治療需要常進(jìn)行較多的血管置管。常見的血管內(nèi)導(dǎo)管(Intravascular catheters，IVCs)包括中心靜脈導(dǎo)管、外周靜脈導(dǎo)管或外周動脈導(dǎo)管等多種類型[1]。IVCs不僅可直接將藥物或營養(yǎng)液安全輸送到血液中，同時也可用于血液動力學(xué)檢測或侵入性血氧測量等多方面。隨著醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步，IVCs在日常醫(yī)療中的地位越來越重要。根據(jù)國外報道，每年在北美IVCs使用量超過3億，在澳大利亞每年也有大約1000萬患者接受IVCs[2]。

然而由于與之相關(guān)的導(dǎo)管相關(guān)血行感染(Catheter-related bloodstream infections,CRBSI)處理不當(dāng)可直接危及患者生命，因此CRBSI也不容忽視。在美國每年發(fā)生多達(dá)25萬例的CRBSI[3]。目前CRBSI的診斷仍依賴于導(dǎo)管及血液的細(xì)菌培養(yǎng)，包括導(dǎo)管培養(yǎng)和血液培養(yǎng)[1]。早期準(zhǔn)確檢測出CRBSI病原體并正確治療，對于CRBSI患者結(jié)局至關(guān)重要。近年來隨著不少檢驗技術(shù)的進(jìn)步，基于非培養(yǎng)的CRBSI診斷有了較大進(jìn)展，因此我們綜述了一些新興的CRBSI診斷方法，以期對今后IVCs相關(guān)的醫(yī)護(hù)工作提供一定幫助。

導(dǎo)管相關(guān)的血行感染的相關(guān)概念

導(dǎo)管病原菌定植指導(dǎo)管尖端、導(dǎo)管的皮下段或?qū)Ч芙宇^處的微生物>15菌落形成單位(Colony Forming Unit, CFU)[1]。血管內(nèi)導(dǎo)管相關(guān)血流感染概念包括以下幾種情況：(1) 出口部位感染：在無血流感染、無伴隨的膿腫等其他感染的情況下，導(dǎo)管出口部位出現(xiàn)紅腫或硬結(jié)(<2 cm)；(2) 隧道感染：在無血流感染或周圍膿腫情況下，距隧道導(dǎo)管(如Hickman導(dǎo)管或Broviac導(dǎo)管)周圍部位出現(xiàn)的壓痛、紅腫或硬結(jié)(>2 cm)；(3) 皮下囊感染：在無血流感染或周圍膿腫情況下，完全植入血管的導(dǎo)管的皮下囊內(nèi)出現(xiàn)膿性液體，常合并表面皮膚的自發(fā)破裂、引流或壞死[1]。

CRBSI的概念指具有發(fā)熱、寒戰(zhàn)和/或低血壓的相關(guān)感染臨床表現(xiàn)，且外周靜脈血培養(yǎng)至少一次病原體陽性，除外導(dǎo)管之外其他感染。CRBSI的診斷主要依賴于導(dǎo)管細(xì)菌培養(yǎng)，且符合以下條件：導(dǎo)管段半定量培養(yǎng)>15CFU或定量培養(yǎng)>103CFU，且導(dǎo)管和血液的培養(yǎng)致病菌相同；或中心靜脈導(dǎo)管抽血與外周靜脈抽血的定量血培養(yǎng)比率>3 ∶1；中心靜脈導(dǎo)管抽血培養(yǎng)與外周血培養(yǎng)陽性時間差值>2小時。細(xì)菌培養(yǎng)陽性時間與微生物總量相關(guān)，當(dāng)患者感染源來自導(dǎo)管時，來自中心靜脈導(dǎo)管的血液將具有更高的微生物量，因此細(xì)菌培養(yǎng)陽性的時間比外周血培養(yǎng)的時間更短。

目前微生物診斷仍以細(xì)菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，在鑒定微生物的同時又可進(jìn)行抗生素耐藥檢測。但近年來，越來越多的IVC相關(guān)不可培養(yǎng)微生物被發(fā)現(xiàn)。對于大多數(shù)微生物培養(yǎng)呈陰性的疑似CRBSI的患者，限制了經(jīng)驗性的抗生素治療。常規(guī)的平皿滾動法半定量或?qū)Ч軘噭踊虺暥考?xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，可能需要2～4天，由于培養(yǎng)時間較長，臨床上容易錯過患者的最佳治療時機(jī)。其次，細(xì)菌培養(yǎng)對于生長緩慢細(xì)菌或不可培養(yǎng)細(xì)菌的診斷價值有限。因此開發(fā)額外診斷方法，彌補(bǔ)常規(guī)培養(yǎng)診斷的不足勢在必行，其中分子生物學(xué)技術(shù)、高通量檢測手段、血清標(biāo)志物等都顯示出了一定潛力[4]。

利用分子生物技術(shù)檢測病原體

臨床工作中對CRBSI的診斷速度對于后續(xù)決策和治療至關(guān)重要。根據(jù)文獻(xiàn)報道，目前已經(jīng)開發(fā)了多種用于檢測CRBSI病原體的分子生物技術(shù)。尤其在國外已經(jīng)有了多種商業(yè)化的診斷檢測方法，下面將對近年來的新興技術(shù)做一介紹。

一、肽核酸-熒光原位雜交技術(shù)

肽核酸-熒光原位雜交技術(shù)(peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization, PNA-FISH)是研究校多的檢測血液培養(yǎng)陽性中具體微生物的技術(shù)之一[5]。主要利用熒光標(biāo)記的肽核酸探針對某些特定細(xì)菌物種的rRNA和念珠菌的rDNA進(jìn)行識別檢測。對不同的微生物種類已經(jīng)有了多種不同的成熟商業(yè)化檢測技術(shù)，包括金黃色葡萄球菌，凝固酶陰性葡萄球菌，糞腸球菌或其他特定腸球菌，大腸桿菌，銅綠假單胞菌和白色念珠菌。PNA-FISH需要制備細(xì)菌陽性的血涂片來進(jìn)行檢測，在顯微鏡下可見熒光標(biāo)記寡核苷酸探針雜交的rRNA，測試時間需要大約2.5～3小時。與細(xì)菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)相比，不同廠家的試劑盒的靈敏度和特異性都很高，均值接近99%和100%[6]。當(dāng)然，在不同試劑盒之間也存在差異，如其中一些對于金黃色葡萄球菌的檢測具有高特異性(99%)，但靈敏度低(72%)[7]。同時，這種方法也具有一定局限性，只能檢測有限種類的病原體。

二、多重PCR雜交技術(shù)

目前利用多重PCR技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌類型鑒定已經(jīng)成熟，其機(jī)理類似ELISA，最典型代表為德國BAG公司的HYPLEX血液檢測試劑盒[8]。多重PCR技術(shù)可檢測甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，化膿性鏈球菌，肺炎鏈球菌，糞腸球菌，大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌，銅綠假單胞菌等多種細(xì)菌。同時也可進(jìn)行細(xì)菌耐藥標(biāo)志物檢測，如VAN基因和多個β-內(nèi)酰胺酶基因。單次檢測時間約為4小時，根據(jù)報道，與金標(biāo)準(zhǔn)相比，多重PCR技術(shù)鑒定致病菌具有較高的靈敏度(96.6%～100%)和特異性(92.5%～100%)[9]。顯然多重PCR技術(shù)與金標(biāo)準(zhǔn)相比更具有時間優(yōu)勢，對臨床早期治療決策有更高價值。

三、基因芯片技術(shù)

根據(jù)報道已經(jīng)有芬蘭的公司研發(fā)出基于基因芯片技術(shù)專為診斷血培養(yǎng)陽性膿毒癥患者的細(xì)菌診斷的試劑盒?；蛐酒瑱z測是基于擴(kuò)增和檢測50個細(xì)菌物種的gyrB，pareE和mecA基因的微陣列形式，可檢測涉及膿毒癥的多種常見病原體，如單核細(xì)胞增生李斯特菌，無乳鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，鮑曼不動桿菌，嗜麥芽窄食單胞菌，流感嗜血桿菌，曼氏奈瑟氏菌，普通擬桿菌和多種的腸桿菌科的菌屬。這種試劑盒的檢測時間約為3小時。在2107個細(xì)菌培養(yǎng)陽性血液樣本的檢測中，對膿毒癥患者的細(xì)菌診斷靈敏度為94%，特異度為96%，尤其對于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌血癥的靈敏度和特異度均為100%[10]。該測定方法的平均時間較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法快18小時，然而，到目前為止對于這項技術(shù)仍缺乏臨床驗證。

此外，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜技術(shù)已用于血液培養(yǎng)陽性樣本中細(xì)菌和真菌種類的鑒定[11]。MALDI-TOF的鑒定時間更短，但是每次只能識別一種特定微生物，無法檢測混合微生物種群，同時需要傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和耐藥檢測進(jìn)行支持。因此其科研價值可能大于臨床應(yīng)用。

顯然，上述技術(shù)均存在相同限制，即多需要在已經(jīng)確認(rèn)為細(xì)菌培養(yǎng)陽性的血液后，才能進(jìn)行細(xì)菌檢測，并不能直接檢測原始血液樣本。因此，這將限制這些方法的臨床應(yīng)用，當(dāng)然未來通過改進(jìn)檢測方法和步驟后直接應(yīng)用于檢測原始血液樣本，可能會具有更大應(yīng)用潛力。

不依賴血培養(yǎng)的病原體檢測方法

由于CRBSI分子診斷均需從血液中獲得高純度基因組DNA，而血液中具有的PCR抑制劑和高表達(dá)的人類DNA對分子診斷檢測具有較強(qiáng)的干擾作用。盡管如此，近年來仍有許多商業(yè)試劑盒在這個領(lǐng)域有了突破進(jìn)展，不僅具有更高的檢測靈敏度和更短的檢測時間，而且可在常規(guī)實驗室中使用。

一、基于PCR和電泳方法的檢測

德國SIRSLab公司生產(chǎn)的VYOO試劑盒是一種基于多重PCR的檢測方法。VYOO可以去除90%以上的人類DNA，從而大大提高了病原體檢測的靈敏度，根據(jù)SIRSLab公司的說明，其可檢測的最小微生物區(qū)間為3～10CFU/mL，可檢測35種細(xì)菌(包括金黃色葡萄球菌，化膿性鏈球菌，肺炎鏈球菌，無乳鏈球菌，糞腸球菌，產(chǎn)氣鏈球菌，蠟樣芽孢桿菌，大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌，陰溝腸桿菌，產(chǎn)氧菌，肺炎克雷伯菌，奇異變形桿菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，摩根氏菌，銅綠假單胞菌，嗜麥芽窄食鏈球菌，流感嗜血桿菌，腦膜炎桿菌，脆弱芽孢桿菌等)以及6種真菌(白色念珠菌、準(zhǔn)筒子菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克魯斯念珠菌和煙曲霉)[12]。此外，還可以檢測5種常見的耐藥基因位點(blaSHV, blaCTX-M, mecA,vanA和vanB)。其整體檢測時間約為8小時。

二、基于PCR和測序鑒定的技術(shù)

德國Molzym公司的SepsiTest是一種針對細(xì)菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因的一種PCR檢測試劑盒?？赏ㄟ^快速擴(kuò)增16S和18S rRNA基因，在4小時內(nèi)檢測血液中的細(xì)菌或真菌。在此基礎(chǔ)上，對陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，并可在8～12小時內(nèi)鑒定出300多種具體病原體。與傳統(tǒng)培養(yǎng)金標(biāo)準(zhǔn)相比較，這種檢測手段的敏感性和特異性分別為88.5%和83.5%[13]。當(dāng)然這種基于PCR和測序方法也可能受到DNA污染導(dǎo)致結(jié)果假陽性的干擾，此外，相對檢測時間較長也可能影響CRBSI的快速診斷而限制其臨床推廣。

三、基于實時PCR的檢測方法

該分析方法主要利用針對DNA特異轉(zhuǎn)錄區(qū)的雙熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)探針法進(jìn)行檢測。例如美國羅氏公司的研制的LightCycler SeptiFast Test是一種可利用多重實時PCR檢測鑒定25種細(xì)菌和真菌的試劑盒?？蓹z測出金黃色葡萄球菌，多種凝固酶陰性葡萄球菌，肺炎鏈球菌及其他鏈球菌，糞腸球菌，大腸桿菌，產(chǎn)氣菌，陰溝腸桿菌，肺炎克雷伯菌等[14]。這種方法同樣可以檢測耐藥基因mecA。此種方法具有一定優(yōu)勢：僅需要在1.5～3 mL血液樣本，檢測時間只有4.5～6小時。此外，由于其可實時檢測，顯著降低了樣本被污染的風(fēng)險。利用16S核糖體RNA基因PCR擴(kuò)增診斷CRBSI也有報道[15]。當(dāng)然此種方法也存在一定不足，當(dāng)樣本中病原體較少時，可能檢測效能不高，同時其缺少耐藥基因檢測及昂貴的檢測價格，可能會限制其臨床應(yīng)用。

四、基于宏基因組學(xué)高通量測序的檢測方法

宏基因組測序是利用高通量DNA測序技術(shù)及相關(guān)的計算和統(tǒng)計方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的新興科學(xué)。宏基因組測序可對混合微生物群落的基因組集合進(jìn)行分析而無需細(xì)菌培養(yǎng)，此外，還可獲得許多微生物群落的遺傳特征。隨著宏基因組測序的開展應(yīng)用，也逐漸發(fā)現(xiàn)了許多新識別的病原體，而這些病原體在繼往是無法通過細(xì)菌培養(yǎng)檢測，此外對多菌感染性質(zhì)病原體的識別也具有一定優(yōu)勢。然而到目前為止，根據(jù)我們的檢索，利用宏基因組測序分析CRBSI的菌群的文獻(xiàn)只有一篇，由Faria等人在2015年發(fā)表的比較健康志愿者和膿毒癥患者的微生物群落[16]。當(dāng)然基因組測序存在一定不足，其檢測陽性并不一定表明存在導(dǎo)致特定感染的活的微生物存在，其診斷閾值也需要進(jìn)一步開發(fā)。目前這種方法需要較多生物信息學(xué)分析的知識支持，目前僅在研究實驗室中使用，可能是將來的一個有潛力的研究方向。

基于血液標(biāo)記物的診斷

通過測量機(jī)體對微生物感染的反應(yīng)是檢測病原體的一種替代方法。生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物加細(xì)菌培養(yǎng)對CRBSI的診斷和治療有一定幫助。盡管生物標(biāo)記物在CRBSI的診斷中的非特異性仍然存在爭議[17]，但其簡便、快速、易于獲得的特點也受到人們的青睞。

一、白細(xì)胞介素-6

白細(xì)胞介素-6 (Interleukin-6，IL-6)是由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的一種炎癥細(xì)胞因子，可對感染性病原體和宿主損傷作出反應(yīng)。由于IL-6半衰期較長，因此可在血液中穩(wěn)定檢測。同時由于IL-6是CRBSI的重要介質(zhì)，已被用于預(yù)測CRBSI的嚴(yán)重程度和患者預(yù)后[18]。當(dāng)然，IL-6是非特異性的生物標(biāo)志物，它的水平在損傷急性期、急性胰腺炎以及腎移植患者中也會升高。因此其應(yīng)用也受到較多限制。

二、C-反應(yīng)蛋白

C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)是一種肝臟來源的急性時相蛋白，可隨IL-6的分泌而增加。炎癥反應(yīng)中CRP的合成開始非常迅速，在6h后血清濃度便可升高并在48h可達(dá)到峰值，但是其半衰期較短為19h，國內(nèi)報道與細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏鑒定為診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究中，CRP診斷CRBSI的敏感性為79.17%[19]。CRP可以在體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)菌吞噬功能。CRP水平同樣可在心肌梗死、自身免疫性疾病等非感染性疾病中升高，因此特異性不高。不能單純依靠CRP水平而判斷CRBSI或指導(dǎo)抗生素治療，但是基于CRP的多指標(biāo)聯(lián)合開發(fā)可能也具有一定潛力。

三、降鈣素原

降鈣素原(Procalcitonin,PCT)是甲狀旁腺產(chǎn)生的無激素活性含116個氨基酸的降鈣素前肽糖蛋白，生理情況下可參與體內(nèi)鈣水平穩(wěn)態(tài)。PCT可產(chǎn)生各種炎癥影響，包括心源性休克、創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)和感染。近些年來，PCT被認(rèn)為可作為微生物感染的重要生物標(biāo)志物。健康人血清中PCT水平較低，CRBSI患者的血清中PCT水平出現(xiàn)明顯升高。據(jù)報道，PCT可作為鑒別CRBSI和全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的兒童的生物標(biāo)志物。然而，據(jù)報道顯示PCT對成人CRBSI和SIRS的鑒別效果卻不甚理想[20]。盡管如此，ICU中CRBSI患者PCT水平持續(xù)升高患者的預(yù)后均較差，也已經(jīng)證實了PCT與CRBSI相關(guān)的器官衰竭評分相關(guān)，因此PCT也是CRBSI最具有診斷潛力的生物標(biāo)志物。當(dāng)然仍需要更多的研究進(jìn)一步在證實其作為快速診斷CRBSI的準(zhǔn)確性和特異性。

四、髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1

髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells 1, TREM-1)是免疫球蛋白超家族的一部分，可在細(xì)菌或真菌感染時上調(diào)。TREM-1與配體結(jié)合時可刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生。值得注意的是，在非感染性炎性疾病中TREM-1上調(diào)不明顯。因此近年來，TREM-1成為具有潛力的感染監(jiān)測指標(biāo)之一。血清可溶性TREM-1(sTREM-1)可由中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、單核細(xì)胞中產(chǎn)生，并且可在人體體液中穩(wěn)定存在。在一項針對44例細(xì)菌培養(yǎng)陽性的發(fā)熱患者研究中sTREM-1對CRBSI的診斷價值，且較CRP和PCT具有更高的特異性和敏感性[21]。然而對于其指導(dǎo)抗生素應(yīng)用仍有很大的研究前景，是今后探索的一個重要方向。

總結(jié)及展望

綜上所述，目前對于CRBSI非培養(yǎng)診斷有了較多進(jìn)展，尤其是分子生物學(xué)的進(jìn)展開辟了CRBSI微生物診斷的新紀(jì)元，PNA-FISH、RT-PCR、基因芯片等多種技術(shù)可直接檢測患者血液標(biāo)本，極大的縮短了檢測時間。此外，隨著高通量測序等多種新興技術(shù)的發(fā)展，其對CRBSI診斷及相關(guān)病原體檢測、耐藥信息獲得具有更多優(yōu)勢。這些基于非培養(yǎng)的診斷可作為常規(guī)培養(yǎng)方法的補(bǔ)充，今后對提高患者的診斷準(zhǔn)確率和改善患者預(yù)后可能會存在幫助，但在應(yīng)用和解釋這些非培養(yǎng)結(jié)果時，需要充分考慮相應(yīng)方法的不足和局限性。我們相信隨著各種新技術(shù)的不斷進(jìn)步和新生物標(biāo)志物的出現(xiàn)， 未來CRBSI的診斷會變得更快、更靈敏和更經(jīng)濟(jì)，在臨床上也將會出現(xiàn)更多成熟的可用于CRBSI診斷的試劑盒或商業(yè)產(chǎn)品。