許 杰， 劉 艷， 樓汪洲洋， 徐 俊， 戚 露， 程良斌

1 湖北中醫(yī)藥大學(xué) a.中醫(yī)臨床學(xué)院; b.信息工程學(xué)院; c.感染病學(xué)教研室，武漢 430060；2 宜昌市中醫(yī)醫(yī)院 脾胃科， 湖北 宜昌 443000；3 湖北省中醫(yī)院 肝病科， 湖北省中醫(yī)院肝病研究所， 武漢 430061

肝纖維化病因較多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝癌的重要一環(huán)[1-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，各種原因?qū)е赂卫w維化的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)居高不下，并逐年升高，肝纖維化產(chǎn)生的諸多并發(fā)癥嚴(yán)重威脅患者的生命健康，并對(duì)社會(huì)造成更為巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[6]，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷和防治肝纖維化，對(duì)于防治肝硬化與肝癌有著極其重要的意義[7]。

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)是構(gòu)成肝竇的主要細(xì)胞，具有較多的窗孔而構(gòu)成篩狀，且內(nèi)皮下無(wú)基底膜的存在，以助于肝細(xì)胞與血竇中各種成分的交換。肝纖維化病變時(shí)，肝竇毛細(xì)血管化，LSEC失去窗孔結(jié)構(gòu)，同時(shí)內(nèi)皮下基底膜形成，導(dǎo)致肝細(xì)胞和血竇之間的物質(zhì)交換障礙，進(jìn)而引起肝竇塌陷及肝細(xì)胞萎縮，最終導(dǎo)致肝纖維化和門靜脈高壓的發(fā)生；此外，LSEC表型也發(fā)生較大改變，表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)志物分化抗原簇31(cluster of differentiation 31，CD31)和血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)[8]。在對(duì)肝竇毛細(xì)血管化的評(píng)判中，認(rèn)為各種原因所致的肝纖維化過(guò)程中肝竇毛細(xì)血管化可作為肝纖維化的最基本特征[9]。目前，肝竇毛細(xì)血管化形成的具體機(jī)制及其發(fā)生、發(fā)展影響因素仍不清楚。對(duì)肝竇毛細(xì)血管化形成原因、過(guò)程以及影響因素等方面進(jìn)行研究，能為進(jìn)一步揭示肝纖維化、肝硬化病理過(guò)程及阻斷肝硬化病理進(jìn)程提供理論依據(jù)[10]。

抗纖軟肝方是湖北省中醫(yī)院肝病科抗肝纖維化的臨床效方，現(xiàn)為院內(nèi)中成藥制劑(批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20113145)。主要藥物由鱉甲、牡蠣、丹參、海藻、莪術(shù)等組成，具有軟肝消痰、活血化瘀的功效，臨床療效已通過(guò)實(shí)驗(yàn)科學(xué)驗(yàn)證和臨床認(rèn)可[11-18]，課題組前期的研究已表明，抗纖軟肝方可以有效改善患者肝功能，降低肝纖維化指標(biāo)，但其藥理學(xué)作用機(jī)制及生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)仍未明確。 本研究擬從肝竇毛細(xì)血管化角度探討抗纖軟肝方抗肝纖維化的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)藥品和試劑 抗纖軟肝顆粒為湖北中醫(yī)院院內(nèi)制劑。蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)自武漢阿斯彭生物科技有限公司(武漢，中國(guó))；兔抗大鼠vWF(工作濃度為1∶150)、山羊抗大鼠CD31(工作濃度為1∶50)購(gòu)自Abcam公司(Cambridge,MA, 美國(guó))；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和兔抗山羊IgG、DAB顯色試劑盒、小鼠抗大鼠β-actin、ECL超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司(武漢，中國(guó))；FBS和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

1.2 含藥血清與細(xì)胞培養(yǎng)基的制備 本研究經(jīng)由湖北省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批[批號(hào)：鄂中醫(yī)院動(dòng)(福)D2018014號(hào)]，所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理規(guī)范。Wistar雄性大鼠16只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖北省疾控中心。將大鼠分為抗纖軟肝方組和對(duì)照組，每組各8只。藥物劑量為60 kg成人等體質(zhì)量常用劑量的6倍量，抗纖軟肝方組生藥40 g/kg大鼠體質(zhì)量灌胃，灌胃容量為10 ml/kg大鼠體質(zhì)量。采取二次重復(fù)給藥的方式，即第1次灌胃給藥2 h后以相同的劑量重復(fù)給藥1次，第2次給藥后1 h于超凈臺(tái)中自下腔靜脈采血，再將收集的血液靜置于4 ℃冰箱3 h，后4 ℃離心機(jī)中離心(3000 r/min，30 min)，超凈臺(tái)中分離血清，再于56 ℃水浴箱中滅活30 min，冷卻后-20 ℃冰箱保存，即為抗纖軟肝方組血清；對(duì)照組用生理鹽水代替抗纖軟肝方藥物給大鼠灌胃，余處理均與抗纖軟肝方組相同，獲取對(duì)照組血清?？估w軟肝方組血清與對(duì)照組血清均分別以10%的濃度加入DMEM配置成含血清培養(yǎng)基用以細(xì)胞培養(yǎng)。最后將配制的培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm濾器除菌待用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 原代LSEC，由武漢原生原代生物公司提供，經(jīng)傳代培養(yǎng)后分為抗纖軟肝方組(母方組，MF)及對(duì)照組(Control)，分別用10%濃度的含藥血清和對(duì)照血清進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 血免疫細(xì)胞化學(xué)法 接種于鋪有蓋玻片的6孔板，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)，一抗分別為兔抗大鼠vWF和山羊抗大鼠CD31，二抗分別為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG。細(xì)胞爬片經(jīng)固定、破膜、封閉、抗體孵育及DAB顯色后，顯微鏡下觀察并拍照，每張載玻片上取8個(gè)高倍視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行吸光度值分析。

1.4.2 Western Blot 用SDS-PAGE凝膠電泳分離的原代LSEC提取物行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜過(guò)濾器上。含5%脫脂奶的PBS溶液封閉過(guò)夜，檢測(cè)vWF和CD31一抗工作濃度分別為1∶1000和1∶200，內(nèi)參β-actin工作濃度為1∶2000，經(jīng)一抗和二抗孵育及ECL超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒曝光，曝光15 min，用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值測(cè)量分析。

1.4.3 掃描電鏡觀察肝竇內(nèi)皮窗孔的變化 6孔板中經(jīng)抗纖軟肝方血清與對(duì)照血清培養(yǎng)的LSEC，PBS清洗3次后，每孔加入2 ml的電鏡固定液，4 ℃冰箱保存，進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)LSEC窗孔結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果

2.1 抗纖軟肝方對(duì)LSEC形態(tài)的影響 采用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)原代LSEC進(jìn)行鑒定，經(jīng)復(fù)合染色確定為原代LSEC(圖1a)。采用倒置顯微鏡觀察LSEC的形態(tài)，與對(duì)照組比較，抗纖軟肝方組對(duì)LSEC形態(tài)學(xué)無(wú)明顯影響(圖1b)。

注：a，免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)LSEC鑒定(×200)；b，抗纖軟肝方對(duì)LSEC形態(tài)影響(×100)。

圖1LSEC鑒定與形態(tài)學(xué)觀察

2.2 抗纖軟肝方對(duì)LSEC中CD31和vWF細(xì)胞因子的影響 在LSEC中CD31主要表達(dá)在胞質(zhì)中，vWF在胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)。與對(duì)照組比較，抗纖軟肝方組CD31和vWF表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD31: 0.069±0.015 vs 0.115±0.011,t=4.257,P<0.05; vWF: 0.092±0.009 vs 0.132±0.014,t=4.274,P<0.05)(圖2)。

2.3 抗纖軟肝方對(duì)LSEC窗孔結(jié)構(gòu)的影響 如圖3所示，對(duì)照組LSEC表面窗孔狹小，數(shù)量減少，許多窗孔結(jié)構(gòu)將近閉塞甚至消失;而抗纖軟肝方組LSEC窗孔結(jié)構(gòu)清晰，窗孔增多、增大，明顯可見(jiàn)，且基底膜明顯減少。

2.4 抗纖軟肝方對(duì)LSEC分子機(jī)制的影響 與對(duì)照組相比，經(jīng)抗纖軟肝方組治療后CD31、vWF的蛋白水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD31：0.334±0.029 vs 0.448±0.013,t=6.245,P<0.01; vWF: 0.560±0.047 vs 0.709±0.045,t=3.966,P<0.05)(圖4)。

3 討論

當(dāng)前，肝纖維化無(wú)創(chuàng)性診斷和有效干預(yù)尚不盡人意，單一藥物的療效可能有限，可能需要聯(lián)合及多靶點(diǎn)嘗試治療[19]。對(duì)于肝纖維化的防治，大量研究[20-22]表明，通過(guò)早期及時(shí)診斷并針對(duì)其原發(fā)致病因素的有效治療，肝纖維化能被有效阻斷，甚至逆轉(zhuǎn)，可以達(dá)到肝硬化不同程度的減輕與緩解。對(duì)肝竇毛細(xì)血管化的研究已有半個(gè)多世紀(jì)，而進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)肝竇毛細(xì)血管化的研究，對(duì)于闡明肝纖維化的發(fā)病進(jìn)展機(jī)制以及逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化方面，意義深遠(yuǎn)[9]。肝竇毛細(xì)血管化的具體分子機(jī)制至今仍未清楚，而肝纖維化過(guò)程中肝竇毛細(xì)血管化與肝星狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞活化之間的關(guān)系，LSEC與細(xì)胞微環(huán)境之間關(guān)系的研究已經(jīng)成為目前肝纖維化具體分子機(jī)制研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

近年針對(duì)肝纖維化的不同靶點(diǎn)、抑制肝星狀細(xì)胞活化與增殖、增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶活性及抑制金屬蛋白酶組織抑制劑的活性、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的藥物及中藥，以及納米顆粒與抗纖維化藥物結(jié)合的治療和基因治療取得顯著的進(jìn)展[5,23]?？垢卫w維化的治療，主要包括兩方面：一是針對(duì)原發(fā)病的病因治療，如抗肝炎病毒、抗血吸蟲(chóng)病、戒酒、祛鐵和祛銅等控制或治愈原發(fā)病；二是針對(duì)抗肝纖維化本身的治療，也是目前臨床和實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，如抑制肝星狀細(xì)胞的激活、抑制膠原的增生、抑制TGFβ的過(guò)表達(dá)、促進(jìn)膠原的降解等，但目前多數(shù)治療處于實(shí)驗(yàn)研究階段[24-25]。

中醫(yī)認(rèn)為肝纖維化為痰瘀互結(jié)之證，抗纖軟肝方具有軟肝消痰、活血化瘀的功效，進(jìn)而起到抗肝纖維化的作用。本文通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，探討抗纖軟肝方對(duì)肝竇毛細(xì)血管化的作用機(jī)制和抗肝纖維化的效果，通過(guò)對(duì)肝纖維化原代LSEC免疫細(xì)胞化學(xué)、Western-Blot檢測(cè)和掃描電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗纖軟肝方具有明顯的抗肝竇毛細(xì)血管化，改善肝纖維化的作用。

LSEC既可以參與肝臟的再生，發(fā)揮保護(hù)作用，又可以參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[26]。原代LSEC在體外經(jīng)傳代培養(yǎng)，會(huì)發(fā)生毛細(xì)血管化現(xiàn)象，但其發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚[8]。為進(jìn)一步從肝竇毛細(xì)血管化的角度明確抗纖軟肝方對(duì)肝纖維化的影響，本研究通過(guò)掃描電鏡檢測(cè)LSEC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組LSEC結(jié)構(gòu)不清，窗孔減少明顯，提示肝竇毛細(xì)血管化可能是肝纖維化痰瘀互結(jié)的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。而抗纖軟肝方可明顯改善LSEC肝竇毛細(xì)血管化的表現(xiàn)，改善窗孔結(jié)構(gòu)，增加LSEC窗孔。

CD31、vWF是反映肝竇毛細(xì)血管化的重要客觀指標(biāo)[27]。為深入探究抗纖軟肝方抗肝竇毛細(xì)血管化的分子機(jī)制，本研究通過(guò)Western-Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定LSEC中CD31、vWF的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，抗纖軟肝方組可顯著降低CD31、vWF的蛋白表達(dá)水平，明顯改善LSEC其肝竇毛細(xì)血管化程度，這可能是其改善LSEC肝竇毛細(xì)血管化，從而達(dá)到抗肝纖維化作用的分子機(jī)制之一。