羅風(fēng)，李曉非

(昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650041)

結(jié)核病是一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題，2017年全球共有640萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病例。成功診斷及治療每年可使上百萬(wàn)結(jié)核病患者避免死亡，最新數(shù)據(jù)顯示，據(jù)估計(jì)2000—2017年共避免5 400萬(wàn)人死亡。但是目前結(jié)核病檢出持續(xù)存在很多漏檢[1]。血清學(xué)分析檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(tuberculosis-specific antigen，TBAg)，具有簡(jiǎn)單、成本低、操作方便和測(cè)定快速等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是篩查結(jié)核病例的有力方法，特別是在中國(guó)、印度等資源有限的國(guó)家[2-3]。在結(jié)核病診斷血清學(xué)研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于尋找在結(jié)核病患者中能引起強(qiáng)烈抗體反應(yīng)的潛在血清診斷抗原，新的結(jié)核病免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)不斷出現(xiàn)。本文著重介紹近幾年國(guó)內(nèi)外關(guān)于結(jié)核病免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方面的新技術(shù)新進(jìn)展，以及新技術(shù)的檢測(cè)原理及優(yōu)缺點(diǎn)，以期促進(jìn)優(yōu)良實(shí)用的結(jié)核病診斷新技術(shù)在我國(guó)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)普及推廣。

1 細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)

1.1體外試驗(yàn)

1.1.1結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)新用法 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-cell spot of Tuberculosis，T-SPOT.TB)基本檢測(cè)原理是利用當(dāng)機(jī)體T淋巴細(xì)胞再次受到具有毒力的TBAg刺激后，活化為分泌結(jié)核分枝桿菌特異性γ干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞，檢測(cè)并計(jì)數(shù)效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，以判斷機(jī)體是否被結(jié)核分枝桿菌感染。試驗(yàn)所使用的TBAg是致病結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)上Rv3874編碼的培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein-10，CFP-10)和Rv3875編碼的早期分泌靶向抗原6(early secreting antigen target-6，ESAT-6)[4-5]。王婷等[6]利用T-SPOT.TB試驗(yàn)對(duì)378例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者和824例體檢健康者進(jìn)行檢測(cè)，得出T-SPOT.TB結(jié)果陽(yáng)性診斷活動(dòng)性結(jié)核的敏感性為91.0%(344/378)，特異性為75.2%(620/824)；同時(shí)該團(tuán)隊(duì)對(duì)T-SPOT.TB結(jié)果進(jìn)行深度分析，發(fā)現(xiàn)TBAg/植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)斑點(diǎn)數(shù)的比值在區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染時(shí)，效果優(yōu)于T-SPOT.TB斑點(diǎn)計(jì)數(shù)判定陰陽(yáng)性的結(jié)果，ROC曲線下面積分別為0.881和0.7～0.8，同時(shí)認(rèn)為該比值在診斷肺外結(jié)核時(shí)也具有一定參考價(jià)值。Feng等[7]在同濟(jì)醫(yī)院招募1 871例研究對(duì)象(包括734例確診肺外結(jié)核患者、1 137例臨床易與肺外結(jié)核混淆的非肺外結(jié)核患者)，分析T-SPOT.TB試驗(yàn)結(jié)果中TBAg/PHA比值對(duì)肺外結(jié)核的診斷及療效監(jiān)測(cè)的性能，結(jié)果證明T-SPOT.TB結(jié)果陽(yáng)性患者中，直接T-SPOT.TB結(jié)果對(duì)區(qū)分肺外結(jié)核和疑似肺外結(jié)核的非肺外結(jié)核患者的診斷價(jià)值有限，TBAg/PHA比值可能是輔助診斷肺外結(jié)核的有用工具；PHA斑點(diǎn)數(shù)值反映了機(jī)體的免疫狀態(tài)，有助于判斷不同免疫狀態(tài)下肺外結(jié)核患者T-SPOT.TB結(jié)果的可信度；TBAg/PHA可用于免疫抑制患者結(jié)核病的輔助診斷，也可能是臨床監(jiān)測(cè)肺外結(jié)核抗癆治療效果的有用指標(biāo)?？傊?，T-SPOT.TB試驗(yàn)在結(jié)核病診斷方面有較高的作用已得到廣泛驗(yàn)證[8-9]，且該試驗(yàn)全球范圍內(nèi)亦得到廣泛應(yīng)用。最新研究對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果各指標(biāo)進(jìn)行深度分析后發(fā)現(xiàn)，該試驗(yàn)不僅能對(duì)結(jié)核病進(jìn)行診斷，還能有效區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核與潛伏性結(jié)核感染以及對(duì)抗癆療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)等[7,10-11]。因此，對(duì)該經(jīng)典試驗(yàn)方法不斷改良以及對(duì)其試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行深度解讀，將使其在臨床結(jié)核病診治方面發(fā)揮更大的作用。

1.1.2T-SPOT.TB相關(guān)改進(jìn)技術(shù) 新型T細(xì)胞檢測(cè)方法(ELISPOT-IL-2技術(shù))基本原理是在T-SPOT.TB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以原核表達(dá)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)PE36-p27蛋白[12-14](其控制基因?qū)儆诮Y(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)域高度保守序列，為PPE36基因Rv2108，屬于PPE蛋白家族)為刺激原，刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2，通過(guò)與固相載體上包被的抗人IL-2單克隆抗體和后加入的生物素標(biāo)記IL-2單克隆抗體分別結(jié)合后，最后加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的鏈霉親合素，形成固相抗人IL-2單克隆抗體-待測(cè)抗原-生物素標(biāo)記IL-2單克隆抗體-HRP標(biāo)記的鏈霉親合素復(fù)合物，洗滌去除雜質(zhì)，顯色(以四甲基聯(lián)苯胺為底物)終止反應(yīng)，在顯微鏡下觀察形成的斑點(diǎn)。2018年Della等[15]報(bào)道可采用LIOSpot?TB試劑盒來(lái)區(qū)分成人患者中潛在結(jié)核病感染和活動(dòng)性結(jié)核病，同時(shí)證明TBAg Ala-DH能刺激活動(dòng)性肺結(jié)核患者機(jī)體產(chǎn)生大量IL-2，而結(jié)核潛伏感染患者產(chǎn)生的該細(xì)胞因子量極低，因此該抗原被認(rèn)為是區(qū)分結(jié)核潛伏感染和活性肺結(jié)核的有用工具。該方法在T-SPOT.TB試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，用TBAg Ala-DH誘導(dǎo)機(jī)體分泌細(xì)胞因子IL-2，然后采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)，來(lái)診斷并區(qū)分潛在結(jié)核病感染和活動(dòng)性結(jié)核病。LIOSpot?TB試劑可以在成人患者中區(qū)分結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核病，但該報(bào)道對(duì)該試驗(yàn)區(qū)分兒童潛在結(jié)核病感染和活動(dòng)性結(jié)核病的性能，接種卡介苗對(duì)該試驗(yàn)的影響等方面尚未得出明確結(jié)論。T-SPOT.TB的多種改進(jìn)技術(shù)在后期將會(huì)進(jìn)一步優(yōu)化，以應(yīng)用于結(jié)核病診療，以上新方法尚未進(jìn)行大量臨床驗(yàn)證，臨床應(yīng)用價(jià)值尚在探索階段[16]。

1.2體內(nèi)試驗(yàn)：重組蛋白(ESAT-6和CFP-10融合蛋白)皮試試驗(yàn) 重組蛋白(ESAT-6和CFP-10融合蛋白)皮試試驗(yàn)是在結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。由于TST的結(jié)核菌素(包括致病、非致病分枝桿菌及卡介苗)成分中含有多種分枝桿菌共同抗原，而卡介苗接種普及，導(dǎo)致TST特異性很差，不能真正反映機(jī)體結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)，臨床應(yīng)用價(jià)值有限[17]。重組蛋白(ESAT-6和CFP-10融合蛋白)皮試試驗(yàn)采用致病結(jié)核分枝桿菌基因RD1區(qū)上Rv3874編碼的CFP-10抗原和Rv3875編碼的ESAT-6抗原，該TBAg在大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌及所有卡介苗菌株上不存在，此突破性技術(shù)進(jìn)展提高了試驗(yàn)的正確性[18]。2018年俄羅斯Slogotskaya團(tuán)隊(duì)[19]對(duì)結(jié)核重組變應(yīng)原(含ESAT6-CFP10蛋白)皮膚試驗(yàn)(Diaskintest)展開(kāi)研究，收集2013—2016年在莫斯科市基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)新診斷活動(dòng)性肺結(jié)核兒童和青少年共441例(其中162例已接種卡介苗)，所有受試者均進(jìn)行Diaskintest和TST試驗(yàn)，最終完成Diaskintest試驗(yàn)421例，完成TST試驗(yàn)414例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)硬結(jié)直徑臨界值為5 mm時(shí)，Diaskintest和TST試驗(yàn)的檢測(cè)敏感性分別為97.9%(412/421)、98.1%(406/414)，而當(dāng)硬結(jié)直徑臨界值為15 mm時(shí)，兩者的檢測(cè)敏感性分別為61.1%(257/412)、46.1%(191/414)，由此得出結(jié)論：當(dāng)硬結(jié)直徑臨界值為15 mm時(shí)，Diaskintest試驗(yàn)檢測(cè)患有活動(dòng)性肺結(jié)核的兒童和青少年的敏感性顯著高于TST試驗(yàn)，且前者在大規(guī)?？ń槊缃臃N條件下具有很高特異性。丹麥哥本哈根Ruhwald博士及其團(tuán)隊(duì)[20]報(bào)道了關(guān)于基于ESAT-6和CFP-10抗原的一種新的特異性皮膚試驗(yàn)(C-Tb)診斷結(jié)核分枝桿菌感染的安全性和有效性研究，該研究自2012年7月24日至2014年10月2日，共招募979名受試者，對(duì)受試者行γ干擾素釋放試驗(yàn)、TST試驗(yàn)和C-Tb試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著被結(jié)核分枝桿菌感染風(fēng)險(xiǎn)的增加，C-Tb檢測(cè)呈強(qiáng)陽(yáng)性趨勢(shì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)C-Tb的安全性與TST相似，結(jié)論為由于其不受卡介苗接種狀態(tài)的影響，C-Tb皮膚試驗(yàn)可在TST常用的環(huán)境中提供更準(zhǔn)確的治療指導(dǎo)依據(jù)。目前，我國(guó)關(guān)于重組融合ESAT6-CFP10免疫原作為皮膚試驗(yàn)試劑用于結(jié)核病診斷的Ⅰ、Ⅱa期臨床試驗(yàn)結(jié)束，相關(guān)數(shù)據(jù)已公布，單劑量1、5、10或20 μg/mL重組ESAT6-CFP10作為結(jié)核分枝桿菌感染診斷的皮膚試驗(yàn)試劑在中國(guó)耐受性好且安全[21-22]，該皮膚試驗(yàn)似乎是一種安全有效的結(jié)核病診斷方法，將進(jìn)一步驗(yàn)證其在鑒別結(jié)核病方面的有效性。綜上，重組蛋白(ESAT-6和CFP-10融合蛋白)皮試試驗(yàn)具有以下優(yōu)點(diǎn)：對(duì)結(jié)核病診斷具有很高的特異性、敏感性，其診斷準(zhǔn)確度與酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)相當(dāng)，卻克服了其實(shí)驗(yàn)材料成本高、需配備實(shí)驗(yàn)室、操作繁瑣等弊端，因此非常適用于資源有限地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)大規(guī)模篩查結(jié)核??；該試驗(yàn)無(wú)卡介苗及其他非致病性分枝桿菌產(chǎn)生的交叉反應(yīng)，在大規(guī)?？ń槊缃臃N條件下具有很高的特異性，可在TST常用的地區(qū)為臨床提供更準(zhǔn)確的診療指導(dǎo)依據(jù)；重組ESAT6-CFP10免疫原在我國(guó)具有良好的耐受性和安全性，目前未有嚴(yán)重不良事件的報(bào)道；且在制備過(guò)程中，重組融合蛋白ESAT6-CFP10相比其他形式的蛋白質(zhì)更穩(wěn)定、有效，因此其被認(rèn)為是診斷結(jié)核分枝桿菌感染的最佳皮膚試驗(yàn)試劑。目前，該試驗(yàn)也存在諸多不足：比如在相關(guān)研究中，納入人群未包含HIV感染者和其他低免疫力人群，也缺乏一定數(shù)量的臨床易與結(jié)核病混淆的非結(jié)核病患者，因此ESAT6-CFP10的敏感性和特異性可能被高估；同時(shí)，以上研究尚未對(duì)不同人群進(jìn)行大樣本檢測(cè)，以確定該試驗(yàn)在不同人群中診斷結(jié)核病的最佳閾值；且該試驗(yàn)區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核與結(jié)核潛伏感染的性能尚不明確，關(guān)于其臨床應(yīng)用價(jià)值還需要進(jìn)一步深入探索研究。

2 體液免疫檢測(cè)技術(shù)

2.1TBAg檢測(cè)技術(shù)

2.1.1免疫熒光雙標(biāo)法聯(lián)合激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)(laser scanning confocal microscopy，LSCM) 免疫熒光雙標(biāo)法聯(lián)合LSCM技術(shù)檢測(cè)腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞ESAT-6，ESAT-6檢測(cè)采用免疫熒光雙標(biāo)法，用LSCM在光源為波長(zhǎng)405 nm和635 nm激光器激發(fā)的雙重?zé)晒鈽?biāo)記下，觀察經(jīng)抗熒光猝滅封片液封片的腦脊液細(xì)胞玻片單核細(xì)胞著色三維成像情況，結(jié)果判定：細(xì)胞胞核呈藍(lán)色熒光、胞質(zhì)呈紅色熒光，為陽(yáng)性；細(xì)胞胞核呈藍(lán)色熒光、胞質(zhì)不著色，為陰性。李美杰等[23]將該方法應(yīng)用于結(jié)核性腦膜炎的早期診斷研究，選取35例確診結(jié)核性腦膜炎患者為病例組，35例其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者為對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，其診斷結(jié)核性腦膜炎的特異性和敏感性分別為97.14%、80.00%，該抗原檢測(cè)方法能為早期結(jié)核性腦膜炎的診斷提供一定依據(jù)。該方法優(yōu)點(diǎn)：(1)檢測(cè)致病菌存在的直接證據(jù)TBAg，特異性高；(2)避免間接檢測(cè)抗原或抗體時(shí)由于患者機(jī)體免疫功能低下導(dǎo)致的假陰性結(jié)果；(3)LSCM技術(shù)在熒光成像基礎(chǔ)上增添激光掃描設(shè)置，進(jìn)一步采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像集中處理分析，具有高分辨性、多重?zé)晒馔瑫r(shí)觀察和三維重建等優(yōu)勢(shì)，與免疫熒光雙標(biāo)法配合，充分發(fā)揮出LSCM的優(yōu)勢(shì)，是觀察細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)的有效工具；(4)該試驗(yàn)可為結(jié)核性腦膜炎臨床早期診斷提供一定依據(jù)。缺點(diǎn)：(1)隨著患者治療時(shí)間的延長(zhǎng)及病情的好轉(zhuǎn)，檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)假陰性；(2)無(wú)法區(qū)分機(jī)體為活動(dòng)性或潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)；(3)該試驗(yàn)的相關(guān)研究招募樣本量有限，未對(duì)多種不同類(lèi)型結(jié)核病的診斷性能進(jìn)行研究，結(jié)果具有一定的局限性。

2.1.2磁珠耦合金納米粒子免疫PCR法(magnetic beads-gold nanoparticles-immuno-PCR，MB-GNP-I-PCR) MB-GNP-I-PCR法[24]檢測(cè)純化的結(jié)核分枝桿菌ESAT-6抗原的基本原理是納米技術(shù)結(jié)合I-PCR技術(shù)，其中I-PCR是一種超靈敏的方法，結(jié)合了ELISA的多功能性和PCR的指數(shù)擴(kuò)增能力[25-26]。該方法的優(yōu)點(diǎn)：(1)該技術(shù)具備納米生物技術(shù)信號(hào)放大的作用和I-PCR技術(shù)中ELISA的簡(jiǎn)單性和多功能性，以及PCR的指數(shù)放大能力和敏感性，可以檢測(cè)出更多的結(jié)核病患者(如涂片陰性肺結(jié)核)，是一種超靈敏的檢測(cè)方法，提高了生物標(biāo)記物的檢出限(MB-GNP-I-PCR技術(shù)檢測(cè)純化的ESAT-6的檢出限為10 fg/mL，是同類(lèi)ELISA的1×105倍)；(2)該技術(shù)開(kāi)創(chuàng)性地提出采用基于納米顆粒的I-PCR技術(shù)檢測(cè)TBAg；(3)該方法試驗(yàn)試劑制備相對(duì)簡(jiǎn)單、試驗(yàn)時(shí)間相對(duì)較短、基質(zhì)效應(yīng)不明顯，在結(jié)核病的臨床診斷方面有廣闊的應(yīng)用前景。不足之處：該方法尚未進(jìn)行大量臨床驗(yàn)證，其臨床應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步深入研究。

2.1.3基于石墨烯/聚苯胺修飾絲網(wǎng)印刷電極的多層電化學(xué)免疫傳感器 馬來(lái)西亞學(xué)者報(bào)道了基于石墨烯/聚苯胺修飾絲網(wǎng)印刷電極的多層電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)TBAg CFP-10在結(jié)核病早期診斷中的應(yīng)用[27]。該新檢測(cè)平臺(tái)在臨床結(jié)核病早期診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，檢測(cè)原理是基于以石墨烯/聚苯胺(graphene/polyaniline，GP/PANI)為納米復(fù)合材料，在絲網(wǎng)印刷金電極(screen-printed gold electrode，SPGE)上制備一種能快速靈敏檢測(cè)相對(duì)分子量為10 000的結(jié)核生物標(biāo)志物CFP-10的夾心式電化學(xué)免疫傳感器，用傅立葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)和場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscopy，F(xiàn)ESEM)對(duì)制備的GP/PANI納米復(fù)合材料進(jìn)行表征，分別用拉曼光譜和FESEM結(jié)合能譜儀研究GP/PANI改性SPGE的化學(xué)鍵和形態(tài)，從研究中可以清楚地看出，通過(guò)滴注技術(shù)成功地將GP/PANI涂層到SPGE上，然后用循環(huán)伏安法研究改性電極的電化學(xué)性能，GP/PANI改性SPGE的有效表面積比裸SPGE提高了5倍左右，最后用差示脈沖伏安法檢測(cè)CFP-10抗原。該檢測(cè)平臺(tái)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、標(biāo)本用量少、快速、一次性使用等特點(diǎn)，能在3 h內(nèi)檢測(cè)到標(biāo)本中的CFP-10，線性范圍為20～100 g/mL(r2=0.99)，估計(jì)檢出限為15 ng/mL；并且檢測(cè)成本低，是一種經(jīng)濟(jì)的結(jié)核病診斷試驗(yàn)替代策略。該新方法尚未進(jìn)行大樣本臨床驗(yàn)證，臨床應(yīng)用價(jià)值尚在探索階段。

2.1.4等離子體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 等離子體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)平臺(tái)是一種超靈敏肉眼可直接判斷結(jié)果的早期結(jié)核病診斷方法，這項(xiàng)技術(shù)利用在過(guò)氧化氫存在下過(guò)氧化氫酶的生物催化作用，具有不同形態(tài)和光學(xué)性質(zhì)的金納米粒子(GNPs)分別在無(wú)靶點(diǎn)或有靶點(diǎn)的情況下產(chǎn)生紅色或藍(lán)色溶液，將納米粒子形成有色溶液與是否存在結(jié)核分枝桿菌特異性分析物(該檢測(cè)平臺(tái)目前主要檢測(cè)結(jié)核病早期特異性候選生物標(biāo)記物CFP-10)聯(lián)系起來(lái)，以快速對(duì)結(jié)核病進(jìn)行診斷[28]。該技術(shù)采用一種新的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制，通過(guò)肉眼和光譜分析檢測(cè)患者痰中CFP-10，克服了傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)在靶標(biāo)分子濃度偏低時(shí)易出現(xiàn)偏差的問(wèn)題，可將痰標(biāo)本中CFP-10檢出限降低至0.01 μg/mL，且超敏、便攜、成本低、操作簡(jiǎn)單、可通過(guò)肉眼讀取結(jié)果，不需要任何昂貴的儀器或?qū)I(yè)技術(shù)人員，特別適用于在資源匱乏國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行結(jié)核病的早期診斷。其性能穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果不受痰標(biāo)本中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，可直接檢測(cè)出樣本中是否存在待測(cè)物。目前該新方法尚未進(jìn)行大樣本臨床驗(yàn)證，臨床應(yīng)用價(jià)值尚在探索階段。

2.2多種免疫分子檢測(cè)技術(shù)：蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)原理是將不同目標(biāo)蛋白質(zhì)按預(yù)先設(shè)置的排列順序有序地固定于各種載體(載玻片、濾膜或滴定板等)表面做成微陣列檢測(cè)芯片，根據(jù)抗原抗體高度特異性結(jié)合的特點(diǎn)，用標(biāo)記了特定熒光物質(zhì)的針對(duì)芯片上蛋白質(zhì)的TBAg或抗體與檢測(cè)芯片反應(yīng)，進(jìn)一步洗滌去除未與芯片上蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的熒光抗原或抗體后，利用激光共聚掃描技術(shù)或熒光掃描儀檢測(cè)芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度分析各種待測(cè)樣本中蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)廣泛用于尋找新藥作用的靶點(diǎn)、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)(如C-12蛋白質(zhì)芯片檢測(cè))、科研等方面[29]。王麗豪等[30]采用蛋白質(zhì)芯片(美國(guó)RayBiotech公司提供的蛋白質(zhì)芯片AAH-CYT-G1000)對(duì)腦脊液中120種細(xì)胞因子進(jìn)行篩選，檢出83種細(xì)胞因子，通過(guò)對(duì)62例入組患者(30例結(jié)核性腦膜炎、16例非感染性神經(jīng)系統(tǒng)疾病和16例病毒性腦膜炎)腦脊液細(xì)胞因子含量的分析比較，最終篩選出γ-干擾素、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-2是結(jié)核性腦膜炎的診斷性細(xì)胞因子。張仁卿等[31]用南京大淵生物技術(shù)公司提供的結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)420例結(jié)核病患者血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果其診斷涂陽(yáng)肺結(jié)核的陽(yáng)性率最高(76.15%)，得出結(jié)核蛋白質(zhì)芯片固定TBAg蛋白16 000、38 000、結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞壁脂多糖抗原(LAM)三抗體聯(lián)合檢測(cè)可提高結(jié)核病的陽(yáng)性檢出率和診斷準(zhǔn)確率，該試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病具有一定輔助診斷價(jià)值。該方法所需檢測(cè)樣本量少、高通量(可同時(shí)對(duì)幾萬(wàn)個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行高通量平行檢測(cè))、能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測(cè)、高靈敏度(利用抗原抗體高度特異性結(jié)合的特點(diǎn))、快速(半小時(shí)出結(jié)果)、方便和微型化、人為主觀誤差降低(自動(dòng)化)，具有檢測(cè)出各種待測(cè)樣本中蛋白質(zhì)的種類(lèi)(結(jié)構(gòu))、量和功能的能力，同時(shí)亦能檢出小肽、受體、抗體、蛋白質(zhì)-DNA、配體、抗原和蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物等[32]。但也存在一些不足：(1)機(jī)體待測(cè)抗體的分布和數(shù)量，由于受到患者免疫狀態(tài)及體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌數(shù)量的影響，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)；(2)無(wú)法區(qū)分以往感染或現(xiàn)癥感染者(由于IgG抗體的免疫特點(diǎn)引起)[33]?？傊Y(jié)核蛋白質(zhì)芯片是近幾年來(lái)結(jié)核病血清學(xué)研究中的一種新方法，在結(jié)核病臨床診斷、療效評(píng)估及科學(xué)研究等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 小結(jié)

綜上，當(dāng)前結(jié)核病免疫學(xué)檢測(cè)新技術(shù)已經(jīng)逐步向以下方向發(fā)展：樣本量微量化；樣本類(lèi)型多樣化(包括血液、尿液、糞便、組織和漿膜腔積液等)；檢測(cè)流程自動(dòng)化；實(shí)效性強(qiáng)(床旁檢驗(yàn))；兼容性強(qiáng)(實(shí)時(shí)、遠(yuǎn)程、網(wǎng)絡(luò)化)；多學(xué)科交融(如融合基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、納米技術(shù)以及電化學(xué)發(fā)光技術(shù)等)；對(duì)結(jié)核病診斷的正確性高，具有一定的抗癆療效評(píng)估價(jià)值；實(shí)驗(yàn)器材便攜且成本低；操作流程簡(jiǎn)單化(無(wú)需配備專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員)等。當(dāng)前新技術(shù)仍不能準(zhǔn)確區(qū)分不同類(lèi)型的結(jié)核病(如活動(dòng)性結(jié)核病與結(jié)核潛伏感染人群)，僅能用于臨床結(jié)核病的輔助診斷，而不能用于確診結(jié)核病，在當(dāng)前眾多新技術(shù)臨床應(yīng)用價(jià)值研究中，大部分研究尚未對(duì)不同人群、不同類(lèi)型結(jié)核病等進(jìn)行大樣本臨床驗(yàn)證，新技術(shù)臨床診斷性能的普適性尚需進(jìn)一步深入探討。只有充分研究每一個(gè)新技術(shù)的檢測(cè)原理、優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍，才能對(duì)其做到合理的應(yīng)用，才能最大限度地發(fā)揮其價(jià)值。盡管世界衛(wèi)生組織鼓勵(lì)對(duì)血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行研究，但本綜述中的大多數(shù)結(jié)核病免疫學(xué)診斷新技術(shù)仍不夠成熟，需要進(jìn)一步深入研究、提煉和優(yōu)化，并進(jìn)行多中心、多地區(qū)、大范圍和多種族的臨床驗(yàn)證，以期能更好地為全球結(jié)核病的防治助力。