曹春玲，楊聰翀，屈小中，韓 冰△，王曉燕△

(1．北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，牙體牙髓科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100081； 2．中國科學(xué)院大學(xué)材料科學(xué)與光電技術(shù)學(xué)院，北京 100049)

近年來，牙髓再生成為口腔牙髓病學(xué)研究的熱點議題之一。牙髓干細(xì)胞(human dental pulp cells，hDPCs)是牙髓組織中易得的一類成體干細(xì)胞[1]，在不同因子和微環(huán)境的調(diào)控下可發(fā)揮其多分化潛能，是牙體組織損傷再生修復(fù)能力的重要影響因素[2-5]。牙髓再生組織工程除了需要干細(xì)胞、支架材料、生長因子的共同作用，還需要支架材料具有可操作性，便于置入狹長細(xì)小的根管空腔中。近來，水凝膠作為組織工程支架用于牙髓再生得到眾多學(xué)者的關(guān)注[6-9]。水凝膠是一種極為親水的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[9]，其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和黏彈性與生物體內(nèi)由生物大分子構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)極為類似，具有良好的生物相容性，可以較好地模擬細(xì)胞生活的微環(huán)境。水凝膠可制備為可注射劑型，可注射水凝膠在根管內(nèi)原位形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)后[8, 10]，可以三維包封細(xì)胞[11-12]。

殼聚糖(chitosan, CS)是天然多糖，此類生物材料的臨床試驗研究表明，將其植入、注射、局部應(yīng)用或攝入動物體內(nèi)后未見任何過敏或炎性反應(yīng)，具有良好的生物相容性，同時又對細(xì)菌、真菌、寄生蟲有一定的毒性，可發(fā)揮天然抑菌作用[13]。羥乙基殼聚糖(glycol-chitosan, GC)是殼聚糖的衍生物，其水溶性得到了提高，便于水凝膠的制備。GC與端苯甲醛基修飾的聚乙二醇(OHC-PEO-CHO)通過席夫(Schiff)反應(yīng)可發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化，形成柔軟的水凝膠網(wǎng)絡(luò)，但GC水凝膠機械強度較低，難以作為組織工程支架提供足夠的力學(xué)支持。因此，本課題組在以GC-OHC-PEO-CHO為水凝膠主網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上穿插了海藻酸鈉(alginate, Alg)-氯化鈣(CaCl2)次網(wǎng)絡(luò)，制備出GC基雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，其力學(xué)性能獲得提升[8]。

水凝膠的力學(xué)性能除與其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)外，也與其組成成分的濃度配比有關(guān)。隨著組分濃度的提高，水凝膠的力學(xué)性能增強[11]。不同力學(xué)性能的水凝膠模擬的細(xì)胞外基質(zhì)硬度不同，影響著其中細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究旨在通過構(gòu)建GC基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠和hDPCs的細(xì)胞支架系統(tǒng)，探索不同組成配比的GC基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其理化性能對hDPCs增殖與分化的作用，為探索更適合根管內(nèi)牙髓再生的材料提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設(shè)備

羥乙基殼聚糖(GC)和海藻酸鈉(Alg)購自美國Sigma-Aldrich公司；苯甲醛修飾的聚乙二醇(OHC-PEO-CHO)由中國科學(xué)院化學(xué)研究所合成； DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國ScienCell公司和天津康源公司；細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；SYBR Green酶購自瑞士Roche公司；Von Kossa染色試劑盒購自北京Solarbio公司。

實驗所用設(shè)備：萬能力學(xué)實驗機購自美國Instron公司；精密電子天平購自瑞士Mettler Toledo公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡購自美國Leica公司；酶標(biāo)儀(ELx800)購自美國BioTek公司；超微量分光光度計(NanoDrop 2000)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；梯度PCR儀(EPS 5345)購自德國Eppendorf公司；real-time RT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 羥乙基殼聚糖基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為羥乙基殼聚糖6%(或3%)，氯化鈣 2%(或1%)，海藻酸鈉6%(或3%)，OHC-PEO-CHO 2%(或1%)的溶液(表1)，將各組分溶液在孔板中輕柔攪拌混合均勻，通過席夫反應(yīng)和靜電相互作用實現(xiàn)在生理環(huán)境條件(pH=7.4, 37 ℃)的雙網(wǎng)絡(luò)凝膠化(下文縮寫為DN3131和DN6262)。

表1 分組及組分濃度Table 1 Component concentration of each group

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為羥乙基殼聚糖3%的溶液和OHC-PEO-CHO 1%的溶液，通過席夫反應(yīng)動態(tài)交聯(lián)實現(xiàn)在生理環(huán)境條件(pH=7.4, 37 ℃)的單網(wǎng)絡(luò)凝膠化 (下文縮寫為GC31)。模式圖見圖1。

1.3 水凝膠的降解性評價

將水凝膠完全浸置于DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，37 ℃條件下放置，每3天更換新的培養(yǎng)液，分別于第0天、第7天、第14天、第21天稱重：將水凝膠表面的液體用吸水紙輕輕擦干，在精密電子天平上稱重。計算重量減少的百分比。

1.4 水凝膠的可注射性研究

根管模型注射實驗：選擇NISSIN透明S1單根管模型，使用Protaper Sx-F3序列預(yù)備，使用手用銼將根管根尖區(qū)預(yù)備至70#。使用雙聯(lián)注射器進(jìn)行模擬根管內(nèi)注射。

體外注射時間測定：恒力15 N施以雙聯(lián)注射器，記錄不同組成配比的水凝膠推出0.5 mL體積所需的時間。針頭型號為21G。

1.5 水凝膠的力學(xué)性能檢測

制備不同濃度配比的GC基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，通過雙聯(lián)混藥器混合注入直徑為10 mm的圓柱形模具，30 min后得到凝膠，脫模得到直徑為10 mm, 高度為10 mm的圓柱體，使用萬能試驗機測定其斷裂應(yīng)力，測試條件：載荷100 N，加載速度1 mm/min。

1.6 GC基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠包封hDPCs三維培養(yǎng)的體外生物學(xué)研究

按照1.4所示步驟及比例制備GC31、DN3131和DN6262，預(yù)先將細(xì)胞消化為懸液，與各組分溶液在孔板中攪拌混合均勻，分別形成3組細(xì)胞終濃度為1×106/mL的GC基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。

1.6.1GC基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠培養(yǎng)hDPCs的增殖能力檢測

hDPCs分別于培養(yǎng)的第1、4、7、10、14天，使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力。Calcein-AM/PI活死細(xì)胞染色法分別對第1、7、14天各組三維培養(yǎng)的細(xì)胞染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)，其中綠染為活細(xì)胞，紅染為死細(xì)胞。

1.6.2礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)條件下，GC基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠培養(yǎng)hDPCs的分化能力檢測

礦化誘導(dǎo)液(含50 mg/L抗壞血酸、5 mmol/L β-磷酸甘油和10 nmol/L地塞米松)浸泡各組水凝膠，體外三維培養(yǎng)14 d后分別檢測成牙本質(zhì)向分化標(biāo)志物及礦化相關(guān)因子的表達(dá)情況和礦化結(jié)節(jié)的形成。每3天更換新的培養(yǎng)液。

1.6.2.1實時熒光定量PCR測定 利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實時熒光定量PCR法檢測DMP-1、DSPP、ALP表達(dá)，相關(guān)引物序列見表2。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，以β-actin為內(nèi)參照，實驗重復(fù)3次。

1.6.2.2組織學(xué)染色 將體外培養(yǎng)14 d細(xì)胞/水凝膠三維支架用PBS沖洗后，固定于4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛中，乙醇序列脫水，制備石蠟切片，厚度為5 μm;然后切片脫臘、水化，進(jìn)行Von Kossa染色。

表2 引物序列Table 2 The chain of reaction primers

DSPP, dentin sialophosphoprotein; DMP-1, dentin matrix protein-1; ALP, alkaline phosphatase.

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,可注射性能、降解率、CCK-8測定、real-time RT-PCR結(jié)果均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠的可注射性能

GC31、DN3131、DN6262在生理條件下(37 ℃, pH=7.4)均可完成溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，GC31的凝膠時間約為200 s，DN3131、DN6262的凝膠時間約為30～50 s，其大體觀如圖2。3組水凝膠都可通過21G針頭順暢推出注入根管模型內(nèi)達(dá)根管全長，其典型過程見圖3。向根管內(nèi)推注相同體積水凝膠，GC31組的推注時間最短，DN3131次之，DN6262推注時間較DN3131長(P<0.05，圖4)。

2.2 水凝膠的斷裂應(yīng)力

GC31單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的斷裂應(yīng)力為1.10 kPa，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的斷裂應(yīng)力高于單網(wǎng)絡(luò)水凝膠(P<0.05)， DN3131的斷裂應(yīng)力為7.33 kPa，DN6262的斷裂應(yīng)力明顯升高，可達(dá)43.30 kPa(圖5)。

2.3 水凝膠的降解性能

GC31水凝膠的體外降解速度最快(P<0.05)，1周后，GC31組的剩余質(zhì)量百分比已不足60%，3周后，GC31組的剩余質(zhì)量百分比已不足20%(圖6A)。雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠降解速率較單網(wǎng)絡(luò)水凝膠明顯更慢，剩余質(zhì)量百分比仍可維持在70%～90%。DN3131組與DN6262組的降解率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)， 3周后雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠大致保持原有形態(tài)(圖6B)。

2.4 hDPCs在水凝膠中的增殖能力

在各組水凝膠中，細(xì)胞均成球形生長，分布較均勻。CCK-8法檢測(圖7A)發(fā)現(xiàn)3組hDPCs均持續(xù)增殖，GC31單網(wǎng)絡(luò)水凝膠組中的細(xì)胞較雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠組的增殖能力高，細(xì)胞數(shù)量多(P<0.05)。雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠組中， DN3131組的hDPCs較DN6262組中的增殖能力高，細(xì)胞數(shù)量多(P<0.05)。Calcein-AM/PI雙染細(xì)胞結(jié)果顯示(圖7B)，活細(xì)胞量均隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，其中GC31組較雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠組中的活細(xì)胞數(shù)量多，且部分細(xì)胞聚集以細(xì)胞團(tuán)的形式存在。

2.5 hDPCs在水凝膠中的分化能力

誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天，DN3131、DN6262中DMP-1和 ALP相對表達(dá)量較GC31組高(P<0.05)。DN3131組中DSPP相對表達(dá)量也高于GC組(P<0.05)，但DN6262組中DSPP相對表達(dá)量與GC31組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖8)。

Von Kossa染色(圖9)結(jié)果顯示，礦化誘導(dǎo)條件下，在DN3131和DN6262組可見明顯的深褐色染色的礦化結(jié)節(jié)，且成團(tuán)塊狀。在GC31組中，在部分細(xì)胞的外周有淺棕色鈣沉積染色，為零星顆粒狀散在分布。

3 討論

水凝膠能夠改良為可注射劑型，能夠適合不規(guī)則的根管形態(tài)[14-15]，在牙髓再生研究中具有良好的應(yīng)用前景。本研究選擇的3組不同組分配比的可注射羥乙基殼聚糖基水凝膠，可通過注射器混合推出，在溫和的生理條件下(37 ℃)發(fā)生溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)化，并且能充盈根管空腔，都具有良好的可操作性，同時，觀察到不同組成配比的水凝膠的可操作時間有所不同。實際操作過程中，可操作時間與溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)化的時間直接相關(guān)，若相轉(zhuǎn)化時間短，則在注射器內(nèi)快速凝膠化后失去流動性，難以注射[16]。本研究GC與OHC-PEO-CHO間的凝膠化是由于動態(tài)共價鍵(亞胺鍵)的形成，反應(yīng)較慢，可操作時間長。而雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中除外GC-OHC-PEO-CHO主網(wǎng)絡(luò), 還互穿海藻酸鈉-CaCl2次網(wǎng)絡(luò)，海藻酸鈉與CaCl2間的離子鍵形成迅速，使雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的溶膠-凝膠相轉(zhuǎn)化時間明顯縮短，可操作時間縮短。當(dāng)交聯(lián)分子的濃度增大，交聯(lián)反應(yīng)速率加快，凝膠時間進(jìn)一步減短，可注射性下降。本研究GC31、DN3131、DN6262的可注射性依次減小，當(dāng)組分濃度進(jìn)一步升高時，出現(xiàn)凝膠堵塞注射針管的情況，難以注射入根管內(nèi)，故本研究未將更高組分濃度的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠納入研究范疇。

對于水凝膠材料，通過調(diào)控各組分配比可以改變其力學(xué)性能和耐降解性能[11, 17-19]。與單網(wǎng)絡(luò)水凝膠相比，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠因其互穿網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)和有效的能量擴散，所以具備較強的韌性、機械強度和穩(wěn)定性[20]。在雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)凝膠交聯(lián)分子的濃度升高，則機械性能增強、基質(zhì)硬度增大、孔隙率降低[21]。本研究觀察到雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的抗壓縮性能、耐降解性能均優(yōu)于單網(wǎng)絡(luò)水凝膠組，且雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠組中，組分濃度高的DN6262組的抗壓縮性能、耐降解性能優(yōu)于組分濃度較低的DN3131組，也證實了以上推論。既往學(xué)者研究表明，牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體類似物形成的時間為3～6周不等，因此支架材料在這段時間內(nèi)維持機械強度的穩(wěn)定,實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性分子的傳遞將對細(xì)胞的分化有著積極的影響[3, 22-23]。

同其他支架材料相比，水凝膠作為可三維包封細(xì)胞的一種支架材料，形成干細(xì)胞龕(niche)，模擬細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞的相互作用，調(diào)節(jié)其中細(xì)胞的自我更新能力和分化能力[24]。有研究表明[25]，同二維培養(yǎng)相比，3D微環(huán)境更能促進(jìn)細(xì)胞的多向分化潛能，但對于細(xì)胞增殖行為的影響尚未確切[26]。目前的牙髓組織工程研究大多局限于將牙源性細(xì)胞種植在支架的表面，研究細(xì)胞在支架表面和內(nèi)部的生物學(xué)行為[27-28]，而對三維培養(yǎng)細(xì)胞的行為改變研究相對較少見。本研究觀察到細(xì)胞在水凝膠中均成球形生長，并形成細(xì)胞球形聚集體，這是由于細(xì)胞在凝膠中不與特定的黏附位點結(jié)合，使細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸和胞間信號交流增強[29]。有研究表明，水凝膠包封的球狀體細(xì)胞更易存活[30]，更不易發(fā)生凋亡。

本研究構(gòu)建的3組可注射型水凝膠對hDPCs增殖能力的促進(jìn)作用不同，其可能原因是由于3組水凝膠理化性能不同，細(xì)胞感受到的細(xì)胞外基質(zhì)硬度不同。細(xì)胞外基質(zhì)硬度可作為機械刺激信號傳遞給細(xì)胞，影響細(xì)胞骨架的收縮和細(xì)胞有絲分裂通路的開啟[31]，從而影響增殖行為。GC水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的GC與OHC-PEO-CHO利用席夫反應(yīng)化學(xué)結(jié)合形成的動態(tài)交聯(lián)鍵在細(xì)胞增殖的過程中維持著斷裂和連接的自我平衡，有利于細(xì)胞間接觸的同時又可以提供一個合適的增殖空間，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖行為。本研究觀察到，在較為柔軟的單網(wǎng)絡(luò)水凝膠模擬的細(xì)胞外基質(zhì)中，人牙髓細(xì)胞表現(xiàn)出較高的增殖能力，證實了以上推論。而雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠由于海藻酸鹽-鈣離子通過離子鍵形成的次網(wǎng)絡(luò)在GC主網(wǎng)絡(luò)中穿插，使分子鏈的密集度升高，細(xì)胞的增殖空間減小，細(xì)胞在其中的增殖行為受到一定程度的抑制。隨著交聯(lián)分子濃度的升高和支架降解速度減慢，細(xì)胞的增殖空間更小，在四周束縛的環(huán)境中，細(xì)胞的增殖相應(yīng)減緩[32]，本研究DN3131組和DN6262組內(nèi)細(xì)胞的增殖能力較低，證實了以上推論。

隨著水凝膠支架基質(zhì)硬度的改變，細(xì)胞的分化行為也受到影響。有研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)硬度較高時，細(xì)胞骨架較為整齊，傾向生成礦化組織，而基質(zhì)硬度較低時，傾向于生成類牙髓樣軟組織[4]。本實驗中，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠模擬的細(xì)胞外基質(zhì)的硬度較高，同時其耐降解性使得較高的硬度得以維持，觀察到DN3131組和DN6262組內(nèi)細(xì)胞成牙本質(zhì)相關(guān)基因和礦化相關(guān)基因的表達(dá)水平和礦化結(jié)節(jié)生成水平均高于GC31組，說明雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠與礦化誘導(dǎo)液協(xié)同作用促進(jìn)了hDPCs成牙本質(zhì)向分化行為。

本研究僅觀察了不同組成配比的GC基水凝膠對hDPCs增殖和分化的影響，對其如何影響hDPCs增殖和分化的分子機制仍需進(jìn)一步探討；需要構(gòu)建動物實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行體內(nèi)試驗；需要進(jìn)一步研究GC基水凝膠對生長因子的載體功能，深入探索其作為牙髓組織工程支架的作用機制，從而發(fā)揮其應(yīng)用潛能。

綜上所述，本研究制備的GC基單/雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠均具有良好的根管內(nèi)可注射性能，其中雙網(wǎng)絡(luò)GC基水凝膠具有更好的耐降解性和力學(xué)性能。hDPCs在各組水凝膠中均持續(xù)增殖，且GC31單網(wǎng)絡(luò)水凝膠更有利于維持細(xì)胞的增殖活力。同單網(wǎng)絡(luò)GC基水凝膠相比，雙網(wǎng)絡(luò)GC基水凝膠在體外實驗中能更有效促進(jìn)hDPCs的成牙本質(zhì)向分化和礦化。