呂欣 曹宇 周達(dá)岸

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（遼寧錦州121000）

骨骼肌鈍挫傷是體育鍛煉中的常見損傷，多發(fā)于腓腸肌和股四頭肌[1]。損傷處局部肌肉的收縮性能較損傷前會(huì)有所降低，并且周圍肌肉再次損傷的概率也會(huì)增加。損傷初期組織周圍水腫、炎性細(xì)胞浸潤、肌纖維排列紊亂；當(dāng)進(jìn)展到修復(fù)期時(shí)，出現(xiàn)新生肌纖維和血管，早期瘢痕形成；到重塑期時(shí)，新生肌纖維粘附在細(xì)胞外基質(zhì)，出現(xiàn)大量瘢痕[2-5]。骨骼肌損傷修復(fù)的病理進(jìn)程離不開相關(guān)基因、蛋白及生長因子等的調(diào)控，它們的啟動(dòng)和傳導(dǎo)又需要信號(hào)通路的激活。其中，IGF-1/PI3K/AKT 信號(hào)通路是重要途徑之一。胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是其重要調(diào)節(jié)起始點(diǎn)，磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（proteinkinase B，PKB，即AKT）能夠被IGF-1 激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及蛋白合成等生理過程[6，7]。已有研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，PI3K/AKT 信號(hào)通路與骨骼肌的修復(fù)再生密切相關(guān)，不僅能夠促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，而且還能刺激更多肌衛(wèi)星細(xì)胞（muscle satellite cells，MSCs）處于增殖狀態(tài)，再生新的肌細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)骨骼肌再生、修復(fù)損傷的作用。目前，以沖擊波作為干預(yù)手段，通過該信號(hào)通路探討骨骼肌損傷修復(fù)作用的相關(guān)研究較少。本研究以沖擊波為干預(yù)措施，研究成肌分化抗原（myogenic differ?entiation antigen，Myod）、肌肉生長抑制素（Myostatin）和肌細(xì)胞生成素（Myogenin）在骨骼肌鈍挫傷修復(fù)時(shí)的表達(dá)變化及沖擊波對(duì)IGF-1/PI3K/AKT 通路的調(diào)控，探討沖擊波對(duì)骨骼肌鈍挫傷的作用效果和可能治療機(jī)制，為臨床治療及科學(xué)研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

由錦州醫(yī)科大學(xué)SPF（specific pathogen free）級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購入21 只健康成年雄性SD（Sprague Daw?ley）大鼠，8～9 周齡，體重180 g ～200 g，飼養(yǎng)溫度控制在20℃～25℃，相對(duì)濕度50%～60%，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2017-0003，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程符合倫理標(biāo)準(zhǔn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將21只大鼠分為正常組、模型組和治療組，每組6 只，其中隨機(jī)選取3只大鼠檢驗(yàn)造模是否成功。

1.1.2 主要試劑及儀器

Myod1 一抗、Myogenin 一抗（美國，abcam）、Myo?statin 一抗（武漢，三鷹），IGF-1 一抗、PI3K（p85）一抗、AKT 一抗、p-AKTSer473 一抗（南京，Biogot），GAPDH（北京，博奧龍），山羊抗兔二抗（美國，Earthox），West?ern blot 相關(guān)試劑（上海，碧云天），電泳及轉(zhuǎn)膜儀（美國，BIO RAD 公司），凝膠圖像掃描及分析系統(tǒng)（美國，BIO RAD公司），免疫組化相關(guān)試劑（北京，索萊寶），體外沖擊波治療儀（瑞士，EMS公司），自制鈍挫傷重物打擊造模裝置。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法

依照Markert等[11]的造模方式，自行設(shè)計(jì)鈍挫傷重物打擊造模裝置。打擊物重260 g，下落高度90 cm，重力為2.55 N，動(dòng)能為2.29 J，打擊頭面積約1 cm2。大鼠雙側(cè)小腿后側(cè)毛在造模前12 h 用電動(dòng)剃毛刀剃除，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液，根據(jù)大鼠體重麻醉（0.2 ml/100 g），俯臥位固定于鼠板上，雙后肢置于伸膝位、踝背屈90°，并且呈稍外展位固定，暴露腓腸肌中段，用紗布?jí)|將后肢墊起，避免后肢懸空造模時(shí)發(fā)生骨折。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：鈍挫傷局部皮膚無開放性破損，腓腸肌腫脹，脛腓骨無骨折，無反?；顒?dòng)（如圖1），造模后大鼠可行走，呈輕微跛行步態(tài)。

造模后12 h隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行HE染色，光鏡下可見肌細(xì)胞破碎，排列不規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤等肌纖維損害標(biāo)志。

圖1 骨骼肌鈍挫傷造模后模型組腓腸肌（右圖為正常組與模型組對(duì)照）

1.2.2 干預(yù)措施及取材

正常組大鼠不作任何處理；模型組大鼠造模后不進(jìn)行沖擊波治療；治療組大鼠于造模后24 h采用沖擊波刺激，作用于大鼠腓腸肌中段。設(shè)定參數(shù)：能流密度0.14 mJ/mm2，頻率10 Hz，沖擊次數(shù)500次，間隔3 d再次治療，于第2次治療后即刻對(duì)各組的6只大鼠進(jìn)行取材檢測(cè)。2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，取各組腓腸肌，每組中的3只大鼠取材后的腓腸肌置于4%多聚甲醛溶液中固定18～24h，再放入30%蔗糖溶液中脫水，冰凍切片，進(jìn)行HE 染色和免疫組織化學(xué)（immunohistochemis?try，IHC）檢測(cè)；每組中另外3只大鼠的腓腸肌組織于?80 ℃冰箱儲(chǔ)存，用于免疫印跡（Western blotting，WB）檢測(cè)。

1.2.3 HE染色方法

腓腸肌組織冰凍切片，橫切8 μm，依次將切片置于蘇木精染色液3 min，分化液30 s，自來水15 min，伊紅染色液1 min，然后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在20×光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2.4 免疫組化方法

冰凍切片橫切，PBS 沖洗，擦掉周圍液體，用組化筆圈出樣品；滴加0.3%甲醇雙氧水，避光30 min；PBS洗；山羊血清室溫封閉1 h，滴加稀釋的Myostatin 一抗50 μL（3% BSA-PBS 稀釋，1︰200），4℃過夜；PBS 沖洗；滴加二抗（1︰3000 稀釋），室溫孵育1 h，PBS 洗，5分鐘×3次；DAB顯色，顯微鏡下觀察染色程度，待細(xì)胞著色，背底顏色淺時(shí)吸去，PBS 洗10 min；復(fù)染，分化，梯度酒精脫水，透明，封片。應(yīng)用Image Pro Plus 分析Myostatin的陽性表達(dá)。

1.2.5 免疫印跡法

取各組標(biāo)本100 mg，于PBS溶液中剪碎，加入適量蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑后勻漿，4 ℃，12000 r/min，離心30 min，取上清液，蛋白定量，100℃煮沸。SDSPAGE電泳，90 V 30 min，110 V 90 min，至溴酚藍(lán)電泳至底部時(shí)終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，300 mA 90 min，7%脫脂奶粉置于室溫2 h，TBST 洗膜后分別放入Myod1（1︰1000）、Myostatin（1︰1000）、Myogenin（1︰500）、IGF-1（1︰1000）、PI3K（p85）（1︰500）、AKT（1︰500）、p-AKTSer473（1︰500）、GAPDH（1︰3000）一抗稀釋液中4 ℃搖床孵育過夜；TBST 洗膜，二抗（1︰10000 稀釋）室溫1 h；洗膜，顯影，成像。Image J軟件分析各個(gè)目的蛋白的條帶灰度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 24.0 軟件對(duì)不同組別數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）和LSD 檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

大鼠造模后，鈍挫傷局部即腓腸肌中段腫脹，皮膚無開放性破損，脛腓骨無骨折，無反?；顒?dòng)，輕微跛行步態(tài)。

2.2 HE染色結(jié)果

正常腓腸肌組織橫切面肌細(xì)胞排列整齊，胞漿呈均勻粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，少量且均勻分布于肌細(xì)胞邊緣（如圖2A）；模型組較正常組可見細(xì)胞排列間隙增寬，肌衛(wèi)星細(xì)胞遷移至細(xì)胞質(zhì)或損傷處周圍，出現(xiàn)肌絲及新生的單核或多核肌小管（如圖2B）；治療組較模型組相比，肌衛(wèi)星細(xì)胞多數(shù)均勻遷至細(xì)胞邊緣，間隙變小，并且多核肌小管增多（如圖2C）。

圖2 3組腓腸肌組織形態(tài)（HE染色，×200，標(biāo)尺=50 μm）

2.3 免疫組化結(jié)果

Myostatin 在細(xì)胞質(zhì)中散在表達(dá)，正常組表達(dá)較少（如圖3A，表1）。模型組出現(xiàn)分布不均勻的棕黃色陽性表達(dá)，與正常組相比表達(dá)顯著升高（如圖3B，表1）（P<0.01）。給予沖擊波干預(yù)后，治療組Myostatin 的陽性表達(dá)減弱，與正常組相比無顯著性差異（P>0.05）；與模型組相比，治療組Myostatin 表達(dá)顯著降低（如圖3C，表1）（P<0.05）。

圖3 3組腓腸肌Myostatin表達(dá)情況（免疫組化，×200，標(biāo)尺=50 μm）

表1 各組大鼠Myostatin表達(dá)量比較（n=3）

2.4 各組大鼠IGF-1/PI3K/AKT 信號(hào)通路及成肌相關(guān)因子的蛋白表達(dá)

由圖4和表2可知：與正常組相比，模型組和治療組PI3K、p-AKT 和AKT 的蛋白表達(dá)均升高（P<0.05），IGF-1 蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.01）；與模型組相比，治療組IGF-1 和p-AKT 的蛋白表達(dá)升高（P<0.01），PI3K 和AKT 的蛋白表達(dá)與模型組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖4 各組大鼠檢測(cè)指標(biāo)免疫印跡圖

由圖4和表3可知：與正常組相比，模型組Myo?genin 蛋白表達(dá)量增加（P<0.05），Myostatin 蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01），Myod1 蛋白表達(dá)雖然增加，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；治療組Myod1 和Myogenin 與正常組相比蛋白表達(dá)增加（P<0.01），Myostatin 相比于正常腓腸肌表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組相比，治療組Myod1 蛋白表達(dá)增加（P<0.01），Myogenin蛋白表達(dá)增加（P<0.05），Myostatin 蛋白表達(dá)下降（P<0.05）。

表3 各組大鼠Myod1、Myostatin和Myogenin蛋白表達(dá)量比較

3 討論

骨骼肌鈍挫傷是較為常見的運(yùn)動(dòng)損傷之一，是由突發(fā)的強(qiáng)大沖擊力所導(dǎo)致的閉合性肌肉損傷。鈍挫傷后腓腸肌血腫并且出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，損傷修復(fù)過程主要依靠激活更多肌衛(wèi)星細(xì)胞，促進(jìn)成肌相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，形成新生的單核或多核肌小管，逐漸融合成新的肌纖維[12]。以往研究表明，IGF-1/PI3K/AKT 信號(hào)通路的激活在促進(jìn)成肌相關(guān)指標(biāo)表達(dá)方面起著至關(guān)重要的作用，通過PI3K 蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)后磷酸化AKT，調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化[9，13]。

本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的沖擊波干預(yù)強(qiáng)度經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)篩選[14，15]，最終確定為0.14 mJ/mm2、10 Hz、沖擊次數(shù)500次。沖擊波通過其具有力學(xué)性質(zhì)的高頻高速振動(dòng)而產(chǎn)生的機(jī)械波作用于受損局部肌肉，通過力-化學(xué)信號(hào)的刺激，增加組織密度，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化，最終使治療靶點(diǎn)內(nèi)損傷腓腸肌組織再生，修復(fù)損傷[16-18]。HE染色結(jié)果顯示，沖擊波治療后原本遷至細(xì)胞質(zhì)和損傷周圍的肌衛(wèi)星細(xì)胞逐漸均勻散布在細(xì)胞邊緣，并且多核肌小管增多，說明沖擊波治療對(duì)骨骼肌損傷的修復(fù)再生具有一定程度的促進(jìn)作用。Myostatin是骨骼肌再生的負(fù)性影響因子，其表達(dá)減少能促進(jìn)骨骼肌再生[19]，并且有研究表明Myostatin與IGF-1呈負(fù)相關(guān)性表達(dá)[8]。免疫組化和Western bloting 結(jié)果顯示，模型組與治療組的Myostatin 蛋白表達(dá)均高于正常組，且治療組表達(dá)低于模型組，說明沖擊波治療能夠抑制腓腸肌鈍挫傷后的Myostatin 蛋白表達(dá)。有研究[20]顯示，高頻振動(dòng)能夠下調(diào)廢用性肌萎縮時(shí)Myostatin 的蛋白表達(dá)，促進(jìn)肌萎縮的修復(fù)，這與本研究結(jié)果一致，并且沖擊波使IGF-1蛋白表達(dá)增加，可能通過直接和間接的雙重影響作用，降低Myostatin蛋白表達(dá)量。

當(dāng)鈍挫傷發(fā)生后，肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化狀態(tài)被激活。Myod1 是肌細(xì)胞增殖標(biāo)志物，本研究結(jié)果提示Myod1 正常組和模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于取材時(shí)Myod1表達(dá)已處于升高后的下降水平。以往研究表明，Myod1在骨骼肌損傷進(jìn)展過程中，在損傷后第1天或第3天表達(dá)量達(dá)到最高，第5天時(shí)下降至與正常組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究結(jié)果一致[21，22]。沖擊波治療后Myod1 蛋白表達(dá)明顯高于正常組和模型組，這與Zissler 等[23]研究結(jié)果一致，可能是沖擊波高頻的機(jī)械振動(dòng)促使其表達(dá)增加。劉宇等[21]研究表明，Myod1在小鼠骨骼肌損傷后第14天達(dá)到第2個(gè)表達(dá)高峰，因此，也有可能是沖擊波治療使Myod1 第2 個(gè)表達(dá)高峰提前。Myogenin是標(biāo)志肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的指標(biāo)之一，骨骼肌損傷3～5天時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞開始融合成肌小管[21，22，24]。本研究中模型組表達(dá)增加，且HE染色顯示出現(xiàn)肌小管，治療組Myogenin表達(dá)量較模型組增加，多核肌管增多，可以推斷沖擊波在肌衛(wèi)星細(xì)胞分化方面具有一定影響作用，一定程度促進(jìn)了肌衛(wèi)星細(xì)胞融合成肌管的過程。

本研究結(jié)果表明，沖擊波治療不能提高骨骼肌鈍挫傷后PI3K和AKT的表達(dá)，但可提高腓腸肌鈍挫傷后IGF-1 和p-AKT（Ser473）的水平，激活肌細(xì)胞內(nèi)的IGF-1/PI3K/AKT 信號(hào)通路，且有研究表明沖擊波對(duì)該信號(hào)通路具有一定調(diào)控作用[25]。IGF-1 是肌纖維形成的早期啟動(dòng)子，能增強(qiáng)成肌細(xì)胞的增殖，也是激活PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵起始因子[9，26]。在正常生理狀態(tài)下，PI3K在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平很低，但當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)，受IGF-1 的調(diào)控，PI3K 活化，同時(shí)表達(dá)水平快速升高[27]。損傷時(shí)，PI3K 的p85 調(diào)節(jié)亞基被募集，相較正常時(shí)表達(dá)增加，與p110亞基結(jié)合，PI3K活化，促使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)變?yōu)?，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）[10，28]。PIP3作為第二信使[29]，招募磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）和AKT 信號(hào)蛋白，三者互相結(jié)合，通過Ser473位點(diǎn)的磷酸化而激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長因子來促進(jìn)細(xì)胞存活[30]。經(jīng)沖擊波干預(yù)后，該條信號(hào)通路被更大程度激活，調(diào)控Myod1、Myogenin 表達(dá)增加，Myostatin表達(dá)減少，增強(qiáng)骨骼肌再生修復(fù)。

本研究結(jié)果提示，IGF-1 /PI3K/AKT 信號(hào)通路的激活很可能參與了沖擊波治療骨骼肌鈍挫傷的作用機(jī)制，通過該通路調(diào)控相關(guān)成肌因子的表達(dá)，從而修復(fù)損傷。

4 結(jié)論

本研究對(duì)沖擊波治療骨骼肌鈍挫傷的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明沖擊波能夠上調(diào)IGF-1 的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控p-AKT 磷酸化水平，激活I(lǐng)GF-1/PI3K/AKT 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)成肌相關(guān)指標(biāo)Myod1、Myostatin 和Myogenin的變化，從而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化，對(duì)鈍挫傷后骨骼肌的再生修復(fù)起到正向調(diào)節(jié)作用。