曹丹，馬林龍，劉艷麗，龔自明，金孝芳

茶樹對硒吸收累積特性及其硒調(diào)控相關(guān)基因的表達分析

曹丹，馬林龍，劉艷麗，龔自明，金孝芳*

湖北省農(nóng)業(yè)科學院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064

本文采用沙培試驗，從動態(tài)角度研究了不同時間和不同濃度下茶樹對硒的吸收累積規(guī)律，并分析相關(guān)基因的表達特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶樹不同部位對硒的累積量存在較大差異，大部分硒保留在根部，在其體內(nèi)的遷移率較低，硒的累積量和外源硒濃度、培養(yǎng)時間顯著相關(guān)；當外源硒濃度在0~0.05?mmol·L-1時，茶樹長勢良好，但當濃度高于0.10?mmol·L-1時，茶樹表現(xiàn)出中毒癥狀。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子及茉莉酸信號途徑中的關(guān)鍵基因丙二烯環(huán)化氧化酶基因（）和脂氧合酶基因（）受到高濃度硒的誘導表達，相關(guān)性分析表明，這3個基因的表達量與根系硒含量呈顯著正相關(guān)。本研究表明，茶樹各部位對硒的累積與外源硒濃度和培養(yǎng)時間顯著相關(guān)，基因、和可能在該過程中發(fā)揮著重要作用。

茶樹；硒；吸收累積；基因表達

硒是人體必需的微量元素，過量或不足均會導致機體產(chǎn)生疾病[1]，近幾年由于其“雙刃劍”作用越來越受到關(guān)注。適量的硒可以清除人體內(nèi)的自由基，具有抗衰老和防癌抗癌等功效[2]；在植物體內(nèi)有助于增強植物的抗逆性，提高品質(zhì)[3-5]。植物是人體攝取硒的主要來源，因此研究植物對硒吸收累積機理意義重大。

茶是世界上廣泛流行的飲品，茶樹富集硒的能力較強，但其吸收、轉(zhuǎn)運和分配的機制并不明確?；诖耍芯空呦嗬^開展了許多相關(guān)試驗，葉飛等[6]認為茶樹對土壤中硒的吸收與土壤pH值有關(guān)，pH在4.5~5.5區(qū)間內(nèi)有利于茶樹對硒的吸收。劉海燕等[7]通過檢測4個田間試驗地12個樣點茶園土壤及其種植的茶葉樣品中的硒含量發(fā)現(xiàn)，茶葉中的硒含量受茶園土壤硒含量、土壤質(zhì)地以及茶園溫濕度等多種環(huán)境因素共同影響。周超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫也會影響茶樹對硒的吸收，當土壤含水率為90%時，茶樹根系硒的累積量最高。然而，因茶樹存在品種和生長環(huán)境等因素的差異性，利用田間取樣分析的結(jié)果可能會有偏差，難以系統(tǒng)全面地揭示出茶樹對硒吸收累積的規(guī)律特征。本研究采用沙培試驗模型，探討茶苗對硒的吸收、轉(zhuǎn)運及累積的特性。實驗室前期對水培茶樹進行硒處理，取其根系和葉片進行了轉(zhuǎn)錄組測序，對其差異基因進行分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子及茉莉酸信號途徑中的關(guān)鍵基因丙二烯環(huán)化氧化酶基因（）和脂氧合酶基因（）在硒處理后顯著上調(diào)表達，推測這些基因與茶樹硒累積相關(guān)[9]。本試驗將繼續(xù)對其在不同處理條件下表達情況進行研究，探索其與茶樹硒累積的關(guān)系，有助于解析茶樹中硒元素的累積機理。

1 材料與方法

1.1 茶樹培養(yǎng)

以金茗1號為試驗材料，該品種是由本課題組采用系統(tǒng)選育的方法從群體種中育成的無性系優(yōu)良品種[10]。采用沙培培養(yǎng)的方式，基質(zhì)為潔凈河沙（沙粒直徑<1?mm），于烘箱中120℃烘干3?h，冷卻后裝入規(guī)格為24.2?cm× 17.4?cm×6.7?cm的藍色周轉(zhuǎn)箱，每箱2?800?g。硒源為Na2SeO3，培養(yǎng)液采用1/3 Hoagland營養(yǎng)液[9,11]，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH至5.0左右，試驗期間每3?d澆1次營養(yǎng)液，每箱500?mL至澆透。

1.1.1 沙培時間對茶樹吸收累積硒的影響試驗

幼苗取回后，用自來水清洗其根部的培養(yǎng)基質(zhì)，然后在蒸餾水中潤洗3次。選取長勢一致的茶苗定植于周轉(zhuǎn)箱中，每箱6株。設(shè)置硒濃度為0.05?mmol·L-1，分別在培養(yǎng)0、1、2、4、8、12、24、48、96、192?h取樣，每次取出3箱，根部用蒸餾水清洗干凈后，將茶苗的幼根、嫩莖（一芽二葉以下約5?cm長的莖段）、一芽二葉分裝用于硒含量測定，另取一部分根部液氮速凍并置于–80℃保存，用于硒調(diào)控相關(guān)基因的表達分析。

1.1.2 硒濃度對茶樹硒吸收累積的影響試驗

選取長勢一致，按照1.1.1章節(jié)所述方法清洗定植茶苗，設(shè)置0、0.01、0.03、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00?mmol·L-1共8個硒濃度處理，每個處理3次重復。處理期間觀察并記錄茶苗形態(tài)變化，3?d后按1.1.1章節(jié)所述方法取樣保存。

1.2 總硒含量測定及遷移系數(shù)

采用HNO3-HClO4（∶=4∶1）消解，消解過程中溫度控制在180℃，將消解液置于6?mol·L-1的HCl中還原，冷卻后定容過濾，利用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法（HG-AFS-8220）測定總硒含量[12]。

莖/根遷移系數(shù)=莖中硒含量/根中硒含量，葉/莖遷移系數(shù)=葉中硒含量/莖中硒含量[13]。

1.3 RNA提取及熒光定量分析

茶樹根系總RNA測定，采用EASYspin plus多糖/多酚復雜植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取，通過M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海英駿生物技術(shù)有限公司）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用KAPA SYBR?FAST qPCR Kit試劑盒（）在ABI7500型熒光定量PCR儀（）進行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20?μL：2×KAPA SYBR?FAST qPCR Master Mix ABI Prism 10?μL，上、下游引物各0.4?μL，cDNA模板1?μL，PCR-grade water 8.2?μL。反應(yīng)步驟：95℃預變性3?min；95℃變性3?s，60℃退火30?s，72℃延伸30?s，40個循環(huán)。分別對各個樣品進行溶解曲線分析，確定每對引物均為特異性擴增，每個基因重復3次。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003和SPSS 19.0 Duncan新復極差法對硒含量進行統(tǒng)計分析，并用Person相關(guān)性分析方法，分析7個時間點和6個濃度處理相關(guān)基因的表達與根部硒含量變化的相關(guān)性，檢驗值＜0.01，使用TBtools軟件繪制基因表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙培時間對茶樹吸收累積硒的影響

茶樹在硒濃度為0.05?mmol·L-1的沙培營養(yǎng)液中培養(yǎng)0~192?h，茶樹幼根、嫩莖、一芽二葉中的硒含量及不同部位的遷移系數(shù)結(jié)果如圖1-A所示。在沙培時間0~4?h和8~48?h，根部硒含量接近直線增長趨勢（硒含量=0.221?3+0.068?5，2=0.990?6；硒含量=0.067?6+0.848?9，2=0.927?4）；而在48~192?h之間，硒含量不再繼續(xù)增加，維持在較高水平。

硒被茶樹根部吸收后，將繼續(xù)向莖部和葉片遷移。如圖1-A所示，莖部硒含量在0~24?h之間緩慢增長，在24~96?h也接近直線增長的趨勢（硒含量=0.018?7-0.145，2=0.965?7），之后在96~192?h保持穩(wěn)定。葉部硒含量在0~24?h內(nèi)未有增加，在24~96?h亦以直線增長趨勢（硒含量=0.001?7+0.075?3，2=0.989?7），在96~192?h呈現(xiàn)出根、莖相似的穩(wěn)定趨勢，表明茶樹在該時間段可能處于硒吸收、轉(zhuǎn)運與分配的動態(tài)平衡中。另一方面，從圖1-B可知，外源硒促進硒從根部向莖段以及從莖段向葉部的遷移，且隨著處理時間的延長，其遷移特征表現(xiàn)出降低的趨勢。

2.2 硒濃度對茶樹吸收累積硒的影響

不同濃度硒處理茶樹，根、莖和葉部硒含量及其遷移系數(shù)的變化如圖2所示。沙培茶樹3?d，硒濃度為0~0.03?mmol·L-1時，茶樹根部硒含量呈直線增長趨勢（硒含量=121.61+0.302?1，2=0.986?0），而莖段和葉部硒含量無顯著變化。當硒濃度為0.03~0.05?mmol·L-1時，根中的硒含量有所下降，同時根部到莖段的轉(zhuǎn)運系數(shù)較之前有所提高，說明這不僅與根部硒濃度有關(guān)，還與硒從根部到地上部的轉(zhuǎn)運相關(guān)。當硒濃度在0.05~0.10?mmol·L-1時，根、莖、葉硒含量均無顯著變化，說明此時可能處于吸收、轉(zhuǎn)運與分配的動態(tài)平衡或飽和狀態(tài)。當硒濃度為0.1~1.0?mmol·L-1時，根莖葉各部位硒含量又接近直線增長趨勢（硒含量=3.387＋1.212?2，2=0.921?4；硒含量=3.786?2－0.158?2，2=0.993?5；硒含量=2.805?1－0.248?4，2=0.891?3），同時根系到莖段、莖段到葉部的遷移系數(shù)也呈上升趨勢，說明此時茶樹根部吸收、轉(zhuǎn)運效率均較高。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，茶樹在此濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)危害癥狀，表現(xiàn)為根系由白色逐漸變紅，葉片發(fā)生褐變，先出現(xiàn)在主脈，再向側(cè)脈延伸，并伴有干枯甚至脫落現(xiàn)象。

2.3 硒累積相關(guān)基因表達及其與硒含量相關(guān)性分析

熒光定量分析發(fā)現(xiàn)、、在不同硒濃度處理及同一濃度的不同處理時間下受到響應(yīng)。如圖3所示，當茶樹處于低硒濃度（0~0.05?mmol·L-1）時，茶樹根系中的這3個基因呈現(xiàn)正常或略下調(diào)表達趨勢，而根部的硒含量呈顯著上升的趨勢（圖2-A），表明這3個基因在此階段不參與調(diào)控硒累積；隨著硒濃度的提高（0.10~1.00?mmol·L-1），茶樹可能受到脅迫，從而激活體內(nèi)的某些調(diào)節(jié)機制，誘導轉(zhuǎn)錄因子以及茉莉酸信號途徑中的關(guān)鍵基因、的上調(diào)表達，增強茶樹的抗逆性，從而使得根系中硒含量繼續(xù)增加?；?、、與茶樹根部硒含量的相關(guān)性分析見表2，基因、、的表達量與硒含量變化呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.802、0.723和0.781。

注：A：不同處理時間對茶樹根、莖、葉硒含量的影響，B：不同處理時間對硒根-莖與莖-葉遷移系數(shù)的影響

注：A：不同硒濃度處理對茶樹根、莖、葉硒含量的影響，B：不同硒濃度處理對硒根-莖與莖-葉遷移系數(shù)的影響

注：A：CsbHLH62、CsAOC、CsLOX6在硒濃度0.05?mmol·L-1不同處理時間的表達量分析，B：CsbHLH62、CsAOC、CsLOX6在不同濃度處理3?d的表達量分析

表2 硒含量與基因表達間相關(guān)系數(shù)

**表示＜0.01顯著水平

**represents extremely significant difference at 0.01 level

3 討論

硒是一種具有保健價值的營養(yǎng)元素，植物中硒是人體攝取硒元素的主要途徑，因此植物對硒的吸收轉(zhuǎn)運、代謝與累積一直都是研究熱點。目前還沒有充分證據(jù)證明硒是植物生長必需的元素，但以往研究發(fā)現(xiàn)硒形態(tài)、施用方法及施用量等對茶樹產(chǎn)量和品質(zhì)有著顯著的影響[14-15]。植物吸收硒的主要形式是硒酸鹽和亞硒酸鹽[16]，亞硒酸鹽易被金屬離子氧化物吸附形成難溶性的復合物，從而降低了硒的移動性，而硒酸鹽則較容易運轉(zhuǎn)且氧化性較強，但易對植物的生長造成毒害[17]。此外，硒酸鹽主要存在于堿性環(huán)境中，而亞硒酸鹽主要存在于酸性環(huán)境中[18]，茶園土壤大多呈酸性，因而本試驗采用亞硒酸鹽作為硒源。硒在植物體內(nèi)主要通過提高抗氧化能力來保護細胞，還對植物的光合作用和呼吸作用等過程有著積極的影響[19]。但是只有適量的硒含量才對植物有正面效應(yīng)，若添加過量則對植物有毒害作用[20-21]。本試驗也得出類似結(jié)論，當硒濃度在0.10?mmol·L-1及以上時，茶樹出現(xiàn)中毒跡象。我國絕大多數(shù)地區(qū)的茶園土壤都缺硒，添加外源硒是生產(chǎn)富硒茶的有效途徑之一。然而，由于茶樹對不同濃度硒的累積特性存在差異，故篩選合適的硒濃度至關(guān)重要。添加外源硒后，茶樹各部位的硒含量均能顯著增加，大體呈現(xiàn)根>莖>葉的趨勢；周鑫斌等[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加亞硒酸鹽后，水稻各器官的硒含量表現(xiàn)為根>葉>莖，說明不同植物對硒的分配規(guī)律有所差異。茶樹吸收的硒大部分都累積在根部，可能是因為亞硒酸鈉被吸收后，先在根部轉(zhuǎn)化為其他硒化物再向地上部運輸，而根系的吸收速率快于其轉(zhuǎn)化為可向地上部運輸?shù)男螒B(tài)，這與水稻、油菜及草莓等的研究結(jié)果一致[23-25]。

植物中硒吸收累積等過程涉及諸多影響因素，包括外界環(huán)境、關(guān)鍵基因的表達及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等。bHLH是一類廣泛存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導和次生代謝調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[26]，本研究中的轉(zhuǎn)錄因子因含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域而屬于此類基因[27]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，該類轉(zhuǎn)錄因子還參與植物對元素的吸收累積，如過表達能增加擬南芥對Zn和Ni的耐受性[28]，同時擬南芥bHLH家族中的、和參與植株對Cd的響應(yīng)[29]。植物激素茉莉酸（Jasmonic acid，JA）也是植物生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物合成的有效誘導因子，大量研究證明，JA可通過提高抗逆性酶的活性，來促進黃酮、生物堿等物質(zhì)的合成及相關(guān)途徑基因表達[26]。廖永翠[30]利用熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，JA信號途徑中的關(guān)鍵基因能顯著響應(yīng)外界刺激，誘導白木香中倍半萜的合成，過表達基因能正向調(diào)控擬南芥倍半萜合酶基因和的表達，最終證實了JA信號途徑參與沉香倍半萜的生物合成。在橡膠樹中，JA分子也可能通過調(diào)節(jié)bHLH等轉(zhuǎn)錄因子的表達，激活與橡膠生物合成相關(guān)的基因，從而提高乳膠的產(chǎn)量[31]。在擬南芥和硒超累積植物的研究中發(fā)現(xiàn)，硒處理可以誘導其體內(nèi)的JA和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）等植物激素合成酶基因的上調(diào)表達，從而誘導體內(nèi)的硒含量增加[32-33]。在本研究中，茶樹經(jīng)硒處理后，各部位的硒含量顯著增加，高濃度硒能誘導轉(zhuǎn)錄因子與JA信號通路中關(guān)鍵基因和上調(diào)表達，這可能是因為高硒濃度處理激活了JA信號通路，進一步調(diào)控其代謝與累積。另外，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子可與MYB轉(zhuǎn)錄因子互作參與類黃酮生物合成、花青素累積等次級代謝[34]，而在茶樹硒富集過程中是否也有類似的調(diào)控機制，有待于進一步的驗證。

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Absorption and Accumulation Characteristics of Selenium in Tea Plant () and Expression Analysis of Genes Related to Selenium Regulation

CAO Dan, MA Linlong, LIU Yanli, GONG Ziming, JIN Xiaofang*

Fruit and Tea Research Institute, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China

The concentration dependence and time course of selenium (Se) absorption and accumulation in tea plant were investigated under sand culture and the expressions of related genes were also analyzed. The results show that the absorption amounts of Se in different tissues of tea plant were remarkably different. Most of them were fixed by the roots, and low movement from roots to shoots was observed. Moreover, the accumulation of Se was significantly correlated with exogenous Se concentration and culture duration. Furthermore, tea plant grew well in the Se concentration from 0 to 0.05?mmol·L-1, but when the concentration was higher than 0.10?mmol·L-1, tea plant showed poisoning symptoms. Fluorescence quantitative PCR analysis indicates that allene oxide cyclase (), lipoxygenase () (key genes of jasmonic acid signaling pathway), as well as a basic helix-loop-helix transcription factor () could be obviously induced by high concentration of Se. The correlation analysis showes that the expressions of these genes were positively related with the Se content in roots. These results suggest that Se accumulation in different tissues of tea plant was significantly correlated with exogenous Se concentration and culture duration, and,,might play important roles in this process.

tea plant, Se, absorption and accumulation, gene expression

S571.1；Q52

A

1000-369X(2020)01-077-08

2019-04-16

2019-08-05

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項目（2019-620-000-001-24）、湖北省農(nóng)業(yè)科學院青年基金項目（2018NKYJJ12）

曹丹，女，助理研究員，主要從事茶樹資源與育種研究，skyiswide@163.com。

xfjin@126.com