程軒軒 陳亮元 鄭詩嘉 唐曉敏 楊全

中圖分類號R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0183-07

DOI

10.6039/j .issn.1001-0408.2 02 0.02.11

摘要 目的：建立廣金錢草多糖的指紋圖譜，分析其單糖組成及含量，并考察廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的體外抑制作用。方法：采用水提醇沉法提取廣金錢草多糖，經(jīng)三氟乙酸水解、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化后，采用高效液相色譜法（HPIC）建立指紋圖譜（以葡萄糖峰為參照），并進(jìn)行單糖組成及含量分析。含量測定色譜柱為Phenomenex LunaC18，流動相為乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8），梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。以阿卡波糖為對照，采用對硝基苯-a-D-葡萄糖吡喃苷法考察廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的體外抑制活性。結(jié)果：18批藥材樣品的HPLC指紋圖譜有9個共有峰，其中15批藥材樣品的相似度大于0.90;共指認(rèn)甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等7個共有峰。其中，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量分別為0.471- 2.092、1.379-8.919、2.560-35.679、1.194- 6.905、0.566-4.158 mg/g;以鼠李糖為基準(zhǔn)，其余4種單糖的摩爾比分別為1.58-4.07、2.26-19.95、2.20-4.21、1.31-2.86。廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)隨劑量升高而增強(qiáng)的趨勢，其半數(shù)抑制濃度為0.70 mg/mL，低于陽性對照阿卡波糖（7.76 mg/mL）。結(jié)論：不同批次廣金錢草的多糖組成均以葡萄糖為主，各單糖含量有所差異。廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶具有明顯的體外抑制作用，且活性強(qiáng)于阿卡波糖。

關(guān)鍵詞 廣金錢草多糖;單糖;含量;指紋圖譜;高效液相色譜法;α一葡萄糖苷酶;抑制活性步研究證實。

廣金錢草為豆科植物廣金錢草[Desmodium styraci-folium （Osb.） Merr.]的干燥地上部分，味甘、淡，性涼，歸肝、腎、膀胱經(jīng)，具有利濕退黃、利尿通淋之效，主治黃疸尿赤、熱淋、石淋、小便澀痛等癥[1]。廣金錢草中的黃酮類成分因具有利尿、抗氧化、抑制大鼠腎結(jié)石形成、改善大鼠離體心臟缺血再灌注損傷等廣泛的藥理活性，是評價藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分，備受學(xué)者關(guān)注[2-5]。除黃酮類成分外，多糖在廣金錢草中的含量也較高，但其相關(guān)藥理學(xué)研究較少?？紤]到植物多糖在抗腫瘤[6]、抗衰老[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、降血脂[9]等方面獨特的生物活性，開發(fā)前景良好，故本研究擬從廣金錢草藥材中提取多糖，采用1一苯基一3一甲基-5一吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化一高效液相色譜法（HPIC）分析其單糖組成，并建立不同產(chǎn)地廣金錢草多糖的指紋圖譜;在測定多糖含量的基礎(chǔ)上，初步評價其對α一葡萄糖苷酶的抑制作用，旨在為全面開發(fā)利用該藥材資源提供依據(jù)。

l 材料

1.1 儀器

LC-20AT型HPLC儀，配有SPD-M20A型二極管陣列（DAD）檢測器、SIL-20A型自動進(jìn)樣器、CT0-20A型柱溫箱、DGU-20A3型真空脫氣機(jī)、LC-20AT型溶液傳輸單元（日本Shimadzu公司）;BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;TG-16WS型臺式高速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）;UV-5200PC型紫外一可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）;Multi-skan GO型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Biosafer-20TB型實驗室級超純水器[賽飛（中國）有限公司];XMTD-8222型電熱恒溫水浴鍋、PH27-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;ST2100型實驗室pH計[奧豪斯儀器（常州）有限公司];N-1100D-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela公司）。

1.2 藥品與試劑

葡萄糖對照品（批號：AF7022401）、阿拉伯糖對照品（批號：AF8051683）均購自成都埃法生物科技有限公司;甘露糖對照品（批號：40708）、半乳糖對照品（批號：10509）、鼠李糖對照品（批號：30521）均購自德國Dr. Eh-renstorfer GmbH公司;半乳糖醛酸對照品（上海金穗生物科技有限公司，批號：20180422）;木糖對照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10026034）;α一葡萄糖苷酶對照品（美國Sigma公司，批號：SLBX6245）;阿卡波糖對照品（批號：J1824027）、對硝基苯-a-D-葡萄糖吡喃苷（ PNPG）對照品（批號：E1828029）均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司;上述對照品的純度均大于98%。0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS） （pH 6.8，福州飛凈生物科技有限公司）;乙腈、磷酸二氫鉀（KH2P04）、PMP等均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

廣金錢草藥材（編號：SI～S18）采自廣東省各栽培基地，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系楊全教授鑒定為豆科植物廣金錢草[D.styracifolium（ Osb.） Merr.]的地上部分。藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（ 250 mm×4.6 mm，5μm）;流動相：乙腈（A相）-0.05 mol/L KH2PO4溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8，B相），梯度洗脫（0～30 min，17%A→ 19%A;30～50 min，19%A）;流速：0.8 mL/min;檢測波長：250 nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合單糖對照品貯備液及其衍生化溶液

精密稱取鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖對照品各適量，置同一量瓶中，加水配制成質(zhì)量濃度分別為0.33、0.88、1.89、0.82、0.45 mg/mL的混合單糖對照品貯備液。精密吸取上述混合單糖對照品貯備液200 μL，置于具塞試管中，依次加入0.3 mol/L氫氧化鈉溶液200 μL和0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μL，混勻，密封，于70℃反應(yīng)1h，取出，冷卻至室溫;精密加入0.3mol/L鹽酸溶液200 μL調(diào)pH至中性，加入12.5%KH2PO4溶液200 μL，搖勻，再加入等體積氯仿萃取3次;棄去氯仿液，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得混合單糖對照品衍生化溶液，備用。

2.2.2 粗多糖及其供試品溶液

采用水提醇沉法提取廣金錢草多糖。稱取廣金錢草藥材樣品適量，粉碎，取粉末5 9，用沸水200 mL回流提取3次，每次1h;趁熱濾過，合并濾液，濃縮后以5 000r/min離心10 min;取上清液，加適量乙醇至含醇量為80%（V/V），于4℃冰箱中放置過夜;以5 000 r/min離心5 min，收集沉淀，凍干，即得粗多糖。精密稱取上述粗多糖50 mg，置具塞試管中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液2 mL，混勻，密封，于100℃水解8h，蒸干，殘渣加甲醇1mL，蒸干，重復(fù)3～5次;殘渣加水8 mL復(fù)溶，即得多糖水解液。取上述多糖水解液200 μL置于具塞試管中，按“2.2.1”項下方法進(jìn)行衍生化處理，即得供試品溶液，備用。

2.2.3 陰性對照溶液

按“2.2.1”項下方法制備不含單糖對照品的陰性對照溶液，備用。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 方法學(xué)考察

（l）精密度試驗：取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S16）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以葡萄糖峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，9個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明該方法的精密度良好。

（2）穩(wěn)定性試驗：取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S16）適量，分別于室溫下放置O、4、8、12、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以葡萄糖峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，9個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

（3）重復(fù)性試驗：取藥材樣品（編號：S16）適量，粉碎，精密稱取粉末適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以葡萄糖峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，9個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.2 HPLC指紋圖譜生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

（l） HPLC指紋圖譜的生成：取18批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對18批藥材樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

（2）相似度評價：采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），以藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜為對照，進(jìn)行整體相似度評價。結(jié)果顯示，18批藥材樣品中，有15批相似度大于0.90，詳見表2。

（3）共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析：18批藥材樣品有9個共有峰，通過與混合單糖對照品衍生化溶液（按“2.2.1”項下方法配制，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的質(zhì)量濃度分別為0.24、0.13、0.35、0.76、0.33、0.07、0.18 mg/mL，其HPLC圖見圖3A）比對，指認(rèn)出1、4、5～9號峰依次為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖。由于6號峰信號強(qiáng)且峰形好，故以其保留時間和峰面積為參照，計算其他色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表3、表4（表中，P1～P9依次對應(yīng)1～9號峰）。

2.4 廣金錢草多糖的單糖含量測定

由于7個共有峰中，有2個單糖（甘露糖、木糖）的含量偏低（低于本方法檢測限），故本研究只檢測了其余5個單糖的含量。

2.4.1 方法學(xué)考察

（l）專屬性：取“2.2”項下混合單糖對照品衍生化溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，對照品和供試品溶液的色譜峰峰形良好，陰性對照溶液對測定無干擾，詳見圖3。

（2）線性關(guān)系考察：精密吸取“2.2.1”項下混合對照品貯備液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.O mL，分別置于2 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。再分別精密吸取上述稀釋后的混合對照品溶液各200 μL，按“2.2.1”項下方法進(jìn)行衍生化處理，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以待測物質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的回歸方程分別為y=13 534x - 63 714 （r=0.999 8）、y=17 053x - 94 675 （r=0.999 6）、y=16 639x+25 588（ r=0.999 4）、y=20 818x-9 100.9 （r=0.999 7）、y=20 065x-42 258（r=0.999 6）.上述各單糖檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為8.25～330.00、22.00～880.00、47.25～1 890.00、20.50～820.00、11.25～450.00 μg/mL。

（3）檢測限與定量限考察：精密吸取“2.2.1”項下混合單糖對照品衍生化溶液適量，以水為溶劑倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比3：1和10：1計算檢測限和定量限。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的檢測限分別為2.06、2.75、2.36、1.03、2.25 μg/mL;定量限分別為4.13、11.00、5.91、2.56、5.63 μg/mL。

（4）精密度試驗：精密吸取“2.2.1”項下混合單糖對照品衍生化溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.48%、3.49%、0.33%、0.64%、0.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

（5）穩(wěn)定性試驗：取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S16）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.53%、2.99%、3.68%、5.82%、4.99%（n=6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

（6）重復(fù)性試驗：取藥材樣品（編號：S16），共6份，粉碎，精密稱取粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖含量的RSD分別為4.53%、4.72%、4.25%、4.71%、4.43%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

（7）加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的樣品（編號：S16）6份，每份50 mg，分別精密加入鼠李糖100μg、半乳糖醛酸240 μg、葡萄糖500μg、半乳糖240 μg、阿拉伯糖150 μg，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均加樣回收率分別為100.77%、102.61%、98.78%、100.60%.101.93% ，RSD分別為3.18%、2.08%、1.70%、1.83%、2.61%（n=6），表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.2 單糖含量測定與摩爾比計算

分別取18批廣金錢草藥材各適量，粉碎，精密稱取藥材粉末5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量[以每克藥材中所含單糖質(zhì)量（mg）計];參考文獻(xiàn)方法[10]，以含量最低的單糖為基準(zhǔn)，計算各單糖的摩爾比。結(jié)果，不同批次廣金錢草藥材中的多糖均以半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖為主，鼠李糖含量均最低，詳見表5、表6。

2.5 廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的體外抑制活性采用PNPG法進(jìn)行考察。

2.5.1阿卡波糖對照品溶液的制備

精密稱取阿卡波糖對照品適量，加水溶解并稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00、25.00 mg/mL的對照品系列溶液。

2.5.2 多糖供試品溶液的制備

精密稱取“2.2.2”項下廣金錢草粗多糖20 mg，加水400 μL使溶解，得粗多糖貯備液。分別量取上述貯備液各適量，加水稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、4.00 mg/mL的多糖供試品溶液。

2.5.3 測定方法及結(jié)果

精密吸取“2.5.1”“2.5.2”項下的阿卡波糖對照品系列溶液和供試品溶液各10 μL，置于96孔板中，加入PBS 60 μL，再加入2U/mLα一葡萄糖苷酶水溶液10 μL，混勻，于37℃孵育15 min;隨后加入5 mmol/L PNPG水溶液20 μL，于37℃孵育20 min，加入0.1 mol/L碳酸鈉溶液50 μL終止反應(yīng)。以水為空白對照，以阿卡波糖為陽性對照，于405 nm波長下測定各孔光密度（OD）值，計算抑制率和半數(shù)抑制濃度（ICso）：抑制率（%）=（OD空n - OD 樣品）/OD空白×100%[11]。各樣品均重復(fù)測定3次，結(jié)果見表7。由表7可知，阿卡波糖和廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的抑制活性均呈現(xiàn)隨著劑量升高而增強(qiáng)的趨勢;廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶抑制活性明顯（IC50=0.70 mg/mL），且強(qiáng)于陽性對照阿卡波糖（IC50=7.76 mg/mL）。

3 討論

3.1 衍生化條件的優(yōu)化 本課題組前期以單糖峰面積為評價指標(biāo)，分別對廣金錢草多糖的酸水解時間、PMP衍生化溫度及衍生化時間進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的柱前衍生化條件（即酸水解8h，70℃下衍生化1 h）。在PMP衍生化過程中，本課題組還比較了磷酸鹽（ KH2P04）的加入對樣品HPLC色譜圖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，于氯仿萃取前在供試品液中加入適量KH2P04溶液，可明顯抑制PMP峰，改善基線狀態(tài)，有利于單糖的定量分析。

3.2 單糖檢測方法的選擇

生物多糖中單糖組成分析常用的方法包括薄層色譜法、氣相色譜峰、HPLC法等。其中，薄層色譜法樣品處理繁瑣，鑒別能力弱，已逐漸被儀器分析方法取代;氣相色譜法對中性單糖的分離效果較好，而對酸性多糖的分離效果較差，且前期處理復(fù)雜、耗時，易出現(xiàn)色譜峰異構(gòu)化裂分;HPLC法可較好地對中性、酸性多糖進(jìn)行分離鑒定[12]。故本研究采用PMP柱前衍生化-HPLC法對廣金錢草多糖的單糖組成進(jìn)行定性、定量分析。結(jié)果顯示，所建HPLC法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，且靈敏度較高。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

本課題組分別比較了乙腈一乙酸銨溶液和乙腈一KH2P04溶液等兩種流動相體系，發(fā)現(xiàn)后者的分離效果更優(yōu)。進(jìn)一步對KH2P04溶液的濃度（0.01、0.02、0.05mol/L）進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，以0.05 mol/L KH2P04溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8）作為有機(jī)相時，各待測物色譜峰峰形的對稱性良好。此外，本課題組還考察了各單糖在YMC-Pack ODS-AQ、Inertsil ODS-3、Phenomenex Lu-na C18等色譜柱上的分離效果，最終確定了本文中的色譜條件。

3.4 指紋圖譜的結(jié)果分析

本研究建立了18批廣金錢草藥材多糖的HPLC指紋圖譜，確定了9個共有峰，并指認(rèn)了其中7個。18批樣品中有15批的相似度超過0.9，表明廣金錢草多糖具有較好的穩(wěn)定性，可作為藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

3.5 單糖定量分析結(jié)果分析

本課題組在18批廣金錢草藥材多糖中共檢測了5種單糖成分的含量，分別為鼠李糖0.471～2.092 mg/g，半乳糖醛酸1.379～8.919 mg/g，葡萄糖2.560～35.679mg/g，半乳糖1.194～6.905 mg/g，阿拉伯糖0.566～4.158 mg/g;以鼠李糖為基準(zhǔn)，半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比分別為1.58～4.07、2.26～19.95、2.20～4.21、1.31～2.86。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地廣金錢草的多糖組成均以葡萄糖為主，鼠李糖的含量最低，且各單糖含量存在差異，可能與產(chǎn)地的土壤、氣候等環(huán)境因素有關(guān)。

3.6 α一葡萄糖苷酶抑制活性的結(jié)果分析

PNPG經(jīng)α一葡萄糖苷酶催化可生成對硝基苯酚（PNP），PNP在400 nm左右波長處有最大紫外吸收，測定此波長下PNP的OD值，可用以計算抑制劑對α一葡萄糖苷酶的抑制率[13]?；诖?，本研究以PNPG為底物、以阿卡波糖為陽性對照，初步評價了廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶具有明顯的體外抑制作用，且活性強(qiáng)于陽性對照阿卡波糖，可為后續(xù)其降血糖作用研究提供依據(jù)。

4 結(jié)語

本研究采用PMP柱前衍生化-HPLC法分析了18批廣金錢草藥材多糖中的單糖組分，并建立了廣金錢草多糖的HPLC指紋圖譜;在此基礎(chǔ)上，通過對單糖組分的定性、定量分析，初步探討了18批廣金錢草藥材多糖的組成特征、單糖含量及摩爾比。本研究還發(fā)現(xiàn)，廣金錢草多糖對僅一葡萄糖苷酶的體外抑制活性強(qiáng)于陽性對照阿卡波糖，提示其可能具有降血糖作用。但本研究尚未對廣金錢草多糖的藥效學(xué)進(jìn)行分析，有待后續(xù)研究進(jìn)一步完善。

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（收稿日期：2019-05-24修回日期：2019-10-18）

（編輯：張元媛）

△基金項目：國家發(fā)展和改革委員會新興產(chǎn)業(yè)重大工程包/國家中醫(yī)藥管理局中藥標(biāo)準(zhǔn)化行動計劃項目（No.ZYBZ-Y-GD-13/ZYY-2017-099）

*副教授，博士。研究方向：中藥化學(xué)成分與藥理活性。電話：020-39352176. E-mail： gdyxycxx@126.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：道地藥材質(zhì)量及形成機(jī)制。電話：020-39352353.

E-mail： yangquan7208@vip.163.com