張 倬,熊 飛,李雪曼,陳天佑

(武漢市第三醫(yī)院胸外科,湖北 武漢 430000)

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP-2,insulin-like growth factor binding protein-2)是胰島素樣生長因子家族中非常重要的一員[1]。在已知研究成果中,IGFBP-2在多種常見惡性腫瘤細(xì)胞中有一定水平的表達(dá),可以調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄序列,影響與腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[2-3]。關(guān)于IGFBP-2基因的表達(dá)變化對食管癌的發(fā)生發(fā)展是否具有一定的影響及其具體作用機(jī)制,目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚無報(bào)道。目前,RNA干擾(RNAi)技術(shù)已經(jīng)被證實(shí)為是一種非常有效的基因治療手段,其主要是通過特異性的沉默目的基因而發(fā)揮一定的作用[3]。研究主要應(yīng)用RNAi技術(shù)將食管癌TE-1細(xì)胞株中IGFBP-2基因沉默,觀察IGFBP-2蛋白表達(dá)變化與食管癌細(xì)胞增殖侵襲及凋亡的關(guān)系,探索IGFBP-2基因在食管癌中的作用,為日后尋找治療食管癌新藥物提供新的干預(yù)靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

食管癌TE-1細(xì)胞株購買于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。重組質(zhì)粒來源于上海閃晶生物技術(shù)有限公司,其攜帶有綠色熒光蛋白的標(biāo)記基因,由上海閃晶生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、合成以及測序。主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS、0.25%胰蛋白酶均為Hyclone公司,鼠抗人IGFBP-2抗體,羊抗鼠抗體(二抗)購于Santa cruz 公司,lipofect2000購于美國invitrogen公司。

1.2 轉(zhuǎn)染并在熒光顯微鏡下觀察

實(shí)驗(yàn)分為4組,分別為A組(轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1組)、B組(轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-2組)、C組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組)以及D組(空白對照組)。在轉(zhuǎn)染前24 h,先用0.25%胰蛋白酶將培養(yǎng)皿中處于對數(shù)生長期的TE-1細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液,以每孔2×105接種于6孔板,待細(xì)胞長滿至90%時開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時,加入250 μL RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋IGFBP-2-SiRNA 質(zhì)粒。與此同時,用250 μL RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋10 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體,輕輕吹打混勻,室溫下靜置5 min。混合IGFBP-2-SiRNA 質(zhì)粒稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000脂質(zhì)體,輕輕吹打混勻。室溫下靜置20 min后將孵育好的混合物加入到不含血清的6孔板中,前后輕搖6孔板混勻。將6孔板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),轉(zhuǎn)染4～6 h后可更換含血清的新鮮培養(yǎng)基,分別在熒光顯微鏡下觀察各組在不同時間點(diǎn)(12 h、24 h、36 h、72 h)轉(zhuǎn)染效率。

1.3 Western blot法鑒定沉默效果

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解并提取蛋白,測定蛋白含量,確定上樣體積,根據(jù)IGFBP-2分子量大小確定制定10%聚丙烯酰胺凝膠,無水乙醇封閉分離膠,40 min后倒掉無水乙醇,超純水清洗3次,配濃縮膠插梳子,聚合30 min后開始電泳。電泳完成后,取出凝膠浸入轉(zhuǎn)膜液,PVDF膜轉(zhuǎn)膜,封閉1 h后,加入稀釋的一抗(1∶800),置于搖床上4 ℃孵育過夜。第二天取出條帶,TBST洗滌3遍,置于離心管中與二抗常溫孵育1 h,TBST洗滌3遍。配好ECL檢測試劑,滴于PVDF膜上,反應(yīng)1～2 min,上機(jī)檢測并分析結(jié)果。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

將4組細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液,并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。吹打均勻后接種于96孔板中,每孔約2×103個細(xì)胞,每孔體積為100 μL,共鋪4個板,每板4組(分別為A、B、C、D組),每組5個孔,待細(xì)胞貼壁后,分別取出每個培養(yǎng)板并加入10 μL的CCK8試劑,分別檢測每組不同時間點(diǎn)(24 h、48 h、72 h、96 h)吸光度,每孔加入10 μL試劑盒內(nèi)檢測液,包裹錫紙避光,常溫反應(yīng)2 h,測量每孔在酶標(biāo)儀450 nm波長處吸光度(A)值,重復(fù)測量3次求平均值,根據(jù)檢測結(jié)果繪制折線圖。

1.5 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h,將各組細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無血清的培養(yǎng)基,8 h后消化細(xì)胞制備成含5%血清的混懸液,密度為1×104個/mL。用50 mg/L Matrigel稀釋液包被濾膜,4 ℃風(fēng)干后于紫外燈下照射2 h,加入培養(yǎng)液,水化。將小室放入24孔培養(yǎng)板,小室外加15%血清1640培養(yǎng)液500 μL,小室內(nèi)加細(xì)胞懸液200 μL,培養(yǎng)72 h后取出小室,用棉簽擦去上層細(xì)胞,染色,熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

用PBS沖洗轉(zhuǎn)染細(xì)胞,制備好細(xì)胞懸液離心,根據(jù)PE Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ試劑盒相關(guān)說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn):用1×binding buffer重懸細(xì)胞,濃度為1×106個/mL。各組吸取100 μL,加5 μL的PE Annexin V和5 μL 7-AAD。常溫避光漩渦孵化細(xì)胞15 min,每組加入400 μL的1×binding buffer,1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染結(jié)果判定

因構(gòu)建的SiRNA載體含有綠色熒光蛋白,轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1、IGFBP-2-SiRNA-2、IGFBP-2-SiRNA-N后,若質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入TE-1細(xì)胞,則熒光顯微鏡可在細(xì)胞核膜及胞漿內(nèi)觀察到綠色熒光。轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1、IGFBP-2-SiRNA-2后細(xì)胞的數(shù)量明顯少于轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-N和空白對照組,這也提示我們IGFBP-2參與了細(xì)胞的分化、增殖(見圖1)。

2.2 IGFBP-2-SiRNA對SATB1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測IGFBP-2蛋白表達(dá)水平,凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描IGFBP-2條帶。1為轉(zhuǎn)染SiRNA-1組,2為空白對照組,3為轉(zhuǎn)染SiRNA-N組,4為轉(zhuǎn)染SiRNA-2組。轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1和IGFBP-2-SiRNA-2組與轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-N和空白對照組相比,IGFBP-2蛋白表達(dá)量明顯下降(見圖2)。轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1和IGFBP-2-SiRNA-2組IGFBP-2/β-actin灰度值與轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-N和空白對照組相比均降低,P<0.01(見表1)。IGFBP-2蛋白表達(dá)量明顯下降,表明IGFBP-2-SiRNA-1和IGFBP-2-SiRNA-2成功轉(zhuǎn)染入食管癌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1和IGFBP-2-SiRNA-2能夠抑制食管癌細(xì)胞IGFBP-2基因表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的改變

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見圖3)轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1、IGFBP-2-SiRNA-2細(xì)胞的生長情況與轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-N和空白對照組細(xì)胞相比較明顯受到抑制。但轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-N和空白對照組細(xì)胞之間以及轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1和IGFBP-2-SiRNA-2組細(xì)胞沒有顯著的區(qū)別。

圖1 轉(zhuǎn)染后48 h TE-1細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá) (100×)Fig.1 Expression of green fluorescent protein of TE-1 cell after 48 h of transfection

圖2 Western blot測定各組細(xì)胞IGFBP-2蛋白結(jié)果Fig.2 IGFBP-2 protein in each groups of cells tested by means of Western blot

2.4 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力的改變

IGFBP-2-SiRNA轉(zhuǎn)染TE-1細(xì)胞后,進(jìn)行基質(zhì)膠涂層膜HE染色。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1組、IGFBP-2-SiRNA-2組在膜上的細(xì)胞數(shù)量少于轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-N組和空白對照組細(xì)胞數(shù)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-N組與空白對照組細(xì)胞之間、轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1組與IGFBP-2-SiRNA-2組之間穿膜細(xì)胞數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),詳見表2。

表1 Western blot灰度值比較

注:a表示P<0.01,與C組相比較;b表示P<0.01,與D組相比較。

圖3 各組TE-1細(xì)胞的生長曲線Fig.3 Growth curves for each group of TE-1 cells

2.5 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡改變

轉(zhuǎn)染后48 h,AnnexinV 與7-AAD 雙染法表示,轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1組、轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-2組早期凋亡的細(xì)胞數(shù)較空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞多(見圖4)。

與空白對照組細(xì)胞相比較,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡改變,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-1組、轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA-2組早期凋亡的細(xì)胞數(shù)較多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),詳見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IGFBP-2基因?qū)E-1細(xì)胞的凋亡具有一定的抑制作用。

表2 各組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)

注:a表示P<0.01,與C組相比較;b表示P<0.01,與D組相比較。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡Fig.4 Apoptosis of cells in each group tested by flow cytometry

表3 各組細(xì)胞凋亡率分析

注:a表示P<0.01,與C組相比較;b表示P<0.01,與D組相比較。

3 討論

食管癌是目前世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,我國食管癌的發(fā)病率、死亡率亦位居世界前列,年平均死亡人數(shù)約15萬人,占全國腫瘤死亡率21.8%,每年的發(fā)病人數(shù)占全世界的一半以上[4]。其中,食管鱗狀細(xì)胞癌是食管癌主要病理類型,大約占所有食管癌的90%[5]。食管鱗狀細(xì)胞癌侵襲性極強(qiáng)、且預(yù)后極差[6]。在我國北部地區(qū),尤其是靠近太行山一帶,食管鱗狀細(xì)胞癌在食管癌所有病理類型致死率中位于首位[7]。但是迄今為止,食管癌的發(fā)病機(jī)制仍不明確,食管癌仍缺乏早期診斷及預(yù)后評估的敏感標(biāo)志物[8-9]。大量研究表明,食管癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移的過程涉及多個相關(guān)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控的變化[5-7],其中關(guān)鍵癌基因的活化和抑癌基因的失活起著至關(guān)重要的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了許多與食管癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因,如c-myc、EGFR、ras 和p16 等,針對這些基因的基因治療也取得了一定的進(jìn)展,但是治療效果并不樂觀[6-9],因此,深入研究食管癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)對于食管癌的預(yù)防和治療具有重要意義。

IGFBP超家族包括:IGFBP- 1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 和IGFBP-6,它們與胰島素樣生長因子IGF-1和IGF-2有很高的親和力[10]。IGFBP-2 與其他IGFBP 家族成員有著相似的氨基端和羧基端,但是它具有獨(dú)特的中間區(qū)域,全部的氨基酸序列中相似的序列近60%,氨基端序列被認(rèn)為在結(jié)合IGF-1和IGF-2中有著重大作用[11]。研究表明IGFBP-2是抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤[12]和前列腺癌[13]發(fā)展的關(guān)鍵因素。IGFBP-2能調(diào)節(jié)IGF及其整合蛋白的通路,IGFBP-2也是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、抵抗各種腫瘤的細(xì)胞因子[14]。但是,IGFBP-2對食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲的作用研究卻很少。

在這項(xiàng)研究中,我們成功的構(gòu)建了IGFBP-2-SiRNA表達(dá)載體,在此基礎(chǔ)上將IGFBP-2-SiRNA-1或IGFBP-2-SiRNA-2轉(zhuǎn)染入食管癌細(xì)胞TE-1,能抑制細(xì)胞增殖和侵襲。此外,IGFBP-2-SiRNA可誘導(dǎo)在體外食管癌細(xì)胞的凋亡的發(fā)生。這些結(jié)果均提示IGFBP-2可能會成為治療食管癌的一個理想靶基因。研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染IGFBP-2-SiRNA后,食管癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降。

研究在細(xì)胞層面對IGFBP-2和食管癌的關(guān)系進(jìn)行了探索,首先是對針對IGFBP-2構(gòu)建出了與之結(jié)合的載體,轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)在4組細(xì)胞中,A組(SiRNA-1)和B組(SiRNA-2)可見明顯綠色熒光,但在48 h后,細(xì)胞逐漸死亡,同樣在C組(SiRNA-N)也可見綠色熒光,但該組細(xì)胞在48 h后仍能繼續(xù)生長,與未轉(zhuǎn)染的D組相差無異,研究初步猜測IGFBP-2可能會影響食管癌細(xì)胞TE-1增殖、凋亡。為此,我們進(jìn)一步在增殖、侵襲和凋亡方面分別做了CCK8、Transwell、流式實(shí)驗(yàn),并對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。在此之前研究還通過對轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞進(jìn)行了Western的檢測,Western的結(jié)果支持了我們的有關(guān)猜想,IGFBP-2引導(dǎo)合成的蛋白在轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中的表達(dá)明顯不同,在用構(gòu)建載體沉默了IGFBP-2的表達(dá)后,該蛋白表達(dá)明顯減少,這也與之前的免疫組化結(jié)果一致。

在CCK8的試驗(yàn)中,研究發(fā)現(xiàn)從48 h后開始,A組(SiRNA-1)、B組(SiRNA-2)與C組(SiRNA-N)、D組(未轉(zhuǎn)染)比較后,在450 nm處的吸光度明顯不同,并且隨著時間的推移,這種區(qū)別越發(fā)明顯,A組、B組2組的細(xì)胞增殖速度明顯慢于C組、D組,可見沉默SATB1對TE-1的增殖有明顯的抑制作用。而在驗(yàn)證細(xì)胞侵襲性的Transwell實(shí)驗(yàn)中,我們統(tǒng)計(jì)不同組細(xì)胞的穿膜數(shù)量,發(fā)現(xiàn)A組、B組穿膜的數(shù)量明顯少于C組、D組,可見TE-1的細(xì)胞侵襲性在沉默IGFBP-2后有了明顯的下降。在最后的流式檢測中,轉(zhuǎn)染的A組、B組細(xì)胞的凋亡率明顯高于C組、D組,尤其是在細(xì)胞生長早期,這也提示IGFBP-2基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞的作用可能發(fā)生在細(xì)胞周期的較早階段,也為后期研究IGFBP-2與食管癌細(xì)胞周期的關(guān)系打下了基礎(chǔ)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面我們得出了一定的研究成果,以此為基礎(chǔ),在以后的研究中進(jìn)行其他層面的探索,比如在組織層面進(jìn)行免疫組化、免疫熒光、Western blot的實(shí)驗(yàn),將食管癌組織與癌旁組織及正常組織進(jìn)行對比,為研究長鏈非編碼RNA與食管癌的關(guān)系進(jìn)行RT-PCR的實(shí)驗(yàn)等,并評估食管癌的預(yù)后,進(jìn)一步為證明IGFBP-2與食管癌的相關(guān)作用提供充分理論依據(jù)。另外,目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的IGFBP家族包含15個成員,其中高親和力組包括IGFBP1-6,剩下的IGFBP家族高親和力蛋白與食管癌乃至其他相關(guān)惡性腫瘤的關(guān)系也值得我們進(jìn)一步探討并研究。