肖琦 趙霞玲 錢雯嫻 郭佳慧 檀濟(jì)敏 俞正玉 汪偉 孫珂 倪艷秀 祝昊丹 周俊明 姚火春 范紅結(jié) 牛家強(qiáng) 索朗斯珠 何孔旺

摘要：為研究豬鏈球菌3型（Ss3）分離菌的生物學(xué)特性及致病性，對(duì)疑似Ss進(jìn)行培養(yǎng)、染色、生化試驗(yàn)、豬鏈球菌PCR鑒定、血清分型PCR鑒定、多位點(diǎn)序列分型（MLST型）PCR鑒定，并對(duì)小鼠和仔豬進(jìn)行致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，3株分離菌（分別命名為JSHZ菌株、GD7菌株、H30菌株）均呈革蘭氏陽(yáng)性，Ss PCR鑒定顯示為陽(yáng)性，血清分型PCR結(jié)果表明分離到的菌株為Ss3，序列型（ST）分別屬于ST27型（JSHZ菌株）、ST1004型（GD7菌株）和ST 117型（H30菌株）;3株分離菌的生化特性與豬鏈球菌相符;3株分離菌經(jīng)腹腔注射均可致死Balb/C小鼠，半致死量（LD50）分別為2.0×107CFU/ml、3.5×107CFU/ml和2.5×108CFU/ml。選擇3株分離菌中毒力較強(qiáng)的JSHZ菌株進(jìn)行仔豬致病性試驗(yàn)，感染仔豬會(huì)出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)紅腫、跛行，體溫多數(shù)升高至40.5～41.8 ℃，精神萎靡，食欲減少等癥狀;高劑量（每頭仔豬注射JSHZ菌數(shù)6.0×109 CFU）處理可致仔豬出現(xiàn)食欲廢絕、神經(jīng)癥狀，甚至瀕死，并在其腦組織中分離到Ss3。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展Ss3的防控研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌3型;生物學(xué)特性;致病性

中圖分類號(hào)：S855.1+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）06-1475-07

Abstract：In order to study the biological characteristics and pathogenicity of Streptococcus suis serotype 3（Ss3） isolates， three strains of suspected Streptococcus suis （Ss）， strain JSHZ and GD7 isolated from acute dead piglets， strain H30 isolated from healthy piglet， were cultured， stained and identified by Ss PCR， Ss serotyping PCR， multilocus sequence typing （MLST） PCR， biochemical tests， and pathogenicity tests were conducted on mice and piglets. The results showed that all the three isolates were Gram-positive and Ss3. The sequence type （ST） of JSHZ， GD7 and H30 belonged to ST27， ST1004 and ST117， respectively. The biochemical characteristics of the three strains were consistent with Ss. The three strains could be lethal to mice by intraperitoneal injection， and the median lethal dose （LD50） were 2.0×107CFU/ml（JSHZ）， 3.5×107CFU/ml（GD7） and 2.5×108CFU/ml（H30）， respectively. The JSHZ with highest virulence to mice was selected for the pathogenicity test on piglets. The results showed that for piglets， JSHZ could cause obvious arthritis and limping， raise the body temperature to 40.5-41.8 ℃， reduce the spirit and appetite. High dose of JSHZ（6.0×109 CFU） could cause piglet anorexia， neurological symptoms and even being dying， and Ss3 was isolated from the brain tissues of dying piglet. This study can lay a foundation for further research on prevention and control of Ss3.

Key words：Streptococcus suis serotype 3;biological characteristics;pathogenicity

豬鏈球菌（Streptococcus suis）可引起仔豬急性死亡、敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等，也可能感染人，甚至導(dǎo)致人死亡，是一種重要的人畜共患病病原菌[1]。豬鏈球菌根據(jù)莢膜可分成33個(gè)血清型（1～31型、33型和1/2型），其中血清2型在病豬和患病人群中的分離率最高[2-3]，血清3、7、9型在許多國(guó)家均較為普遍[4-5]。流行病學(xué)資料顯示，豬鏈球菌2型、3型是加拿大和美國(guó)最主要的流行血清型[1]。在中國(guó)，Wei等[6]對(duì)2003-2007年全國(guó)16個(gè)省（市）分離的407株豬鏈球菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2型為主要的血清型，占43.2%;其次是3型，占14.7%。王巍[7]從四川省20個(gè)縣（區(qū)）不同日齡的發(fā)病豬中分離到34株豬鏈球菌，其中豬鏈球菌2型最多，占47.1%;其次是豬鏈球菌7型，占26.5%;豬鏈球菌3型排名第3，占11.8%。董志民等[8]對(duì)2009-2016年中國(guó)部分地區(qū)病料中分離的41株豬鏈球菌進(jìn)行血清分型鑒定，血清2型或1/2型共10株（24.4%），9型7株（17.1%），3型6株（14.6%）。上述研究結(jié)果表明，豬鏈球菌3型（Ss3）在中國(guó)部分豬群中占據(jù)著非常重要的地位，但有關(guān)Ss3培養(yǎng)特性、生化特性、基因特征及致病性的詳細(xì)報(bào)告較少。

1.10.2.2試驗(yàn)二選取5頭30日齡健康仔豬，喂7 d無(wú)抗飼料，隨機(jī)分成2組，一組3頭，一組2頭。選取方法1.10.1小鼠致病性試驗(yàn)中毒力較強(qiáng)的1株菌株，2組試驗(yàn)組仔豬分別注射菌液原液（原液組2）和10倍濃縮液，每頭仔豬耳緣靜脈注射2 ml。仔豬感染后的觀察、測(cè)溫、細(xì)菌分離鑒定、剖檢、組織學(xué)觀察均與方法1.10.2.1一致。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)染色鑒定

采集的病料樣品在THB固體培養(yǎng)基上劃線，然后在THB液體培養(yǎng)基中增菌，純培養(yǎng)后獲得單一純菌落，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從急性死亡豬肺臟中分離到的2株菌株（分別命名為JSHZ菌株和GD7菌株）為疑似豬鏈球菌，從健康豬扁桃體中分離到的1株菌株（命名為H30菌株）也為疑似豬鏈球菌，各分離菌在THB固體培養(yǎng)基上均長(zhǎng)成灰白色菌落，菌落直徑為1～2 mm。分離菌涂片經(jīng)革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察，為藍(lán)紫色的短鏈狀球菌。

2.2豬鏈球菌PCR鑒定

利用Ss gdh擴(kuò)增引物對(duì)獲得的3株豬鏈球菌疑似菌株進(jìn)行PCR鑒定和序列比對(duì)，結(jié)果（圖1）顯示，3株分離菌均能擴(kuò)增出689 bp左右大小的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。擴(kuò)增片段序列與Ss HB30菌株gdh基因（序列號(hào)FJ572237.1）100%同源，說(shuō)明分離到的3株菌株均為Ss。

2.3豬鏈球菌血清型PCR鑒定

對(duì)3株分離菌進(jìn)行Ss血清型PCR鑒定和序列比對(duì)，結(jié)果（圖2）顯示，僅Ss3引物PCR能擴(kuò)增出大小約為340 bp的目的片段，其他各血清型引物PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。Ss3引物PCR擴(kuò)增的片段序列與Ss3 cps3L基因（序列號(hào)KC537365.1）100%同源，表明分離到的3株菌株均為Ss3。

2.4MLST型PCR鑒定

MLST型PCR鑒定結(jié)果（表1）顯示，3株分離菌分屬3個(gè)不同的ST型，JSHZ菌株屬于ST27型，GD7菌株屬于ST1004型，H30菌株屬于ST117型。

2.5生化試驗(yàn)

在馬尿酸鈉、6.5%NaCl高鹽肉湯、甘露醇、山梨醇、木糖、阿拉伯糖、七葉苷、尿素試驗(yàn)中，3株分離菌的結(jié)果為陰性;在乳糖、血清菊糖、水楊素、棉子糖、蕈糖、蔗糖、葡萄糖試驗(yàn)中，3株分離菌的結(jié)果為陽(yáng)性。表明3株Ss3分離菌均符合Ss的生化特性。

2.6分離菌株生長(zhǎng)曲線

圖3顯示，JSHZ菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為培養(yǎng)后0～5 h，GD7菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為培養(yǎng)后0～3 h，H30菌株的生長(zhǎng)速度較為緩慢，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不明顯。在生長(zhǎng)平臺(tái)期，JSHZ菌株和GD7菌株的活菌數(shù)分別達(dá)到2.50×108CFU/ml和2.85×108CFU/ml，而H30菌株的活菌數(shù)僅為2.25×107CFU/ml。說(shuō)明從急性死亡豬肺臟中分離到的2株Ss3菌株（JSHZ菌株、GD7菌株）生長(zhǎng)比較快，生長(zhǎng)平臺(tái)期的菌數(shù)較多;而從健康豬扁桃體中分離到的Ss3菌株（H30菌株）生長(zhǎng)比較慢，生長(zhǎng)平臺(tái)期的菌數(shù)較少。

2.7致病性

2.7.1對(duì)小鼠的致病性表2顯示，用不同稀釋倍數(shù)的JSHZ、GD7、H30菌液對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行腹腔注射，注射后4 h，各組均有部分小鼠開(kāi)始出現(xiàn)被毛粗亂、精神萎靡等癥狀，隨后多數(shù)表現(xiàn)出拉稀、閉眼，有的出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。Balb/C小鼠死亡主要發(fā)生在14～48 h。死亡小鼠的血液及肝、脾、肺、腦中均能分離到大量菌落形態(tài)單一的Ss，血清分型PCR鑒定結(jié)果均為Ss3。JSHZ、GD7、H30菌株對(duì)4周齡Balb/C小鼠的半致死量（LD50）分別為2.0×107CFU/ml、3.5×107CFU/ml和2.5×108CFU/ml，說(shuō)明JSHZ菌株對(duì)Balb/C小鼠的致病性最強(qiáng)，而H30菌株對(duì)Balb/C小鼠的致病性相對(duì)較弱。

2.7.2對(duì)仔豬的致病性

2.7.2.1試驗(yàn)一結(jié)果（表3）顯示，仔豬在感染JSHZ菌液后18～42 h出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、跛行、體溫升高、精神萎靡、食欲減少等臨床癥狀。在感染后的第1 d仔豬體溫升高，多數(shù)為40.5～41.0 ℃，最高可達(dá)41.3 ℃，但在感染后的第2～3 d體溫全部恢復(fù)正常。關(guān)節(jié)紅腫和跛行等癥狀也在感染后第3～4 d消失，所有仔豬在觀察期內(nèi)均未死亡。感染仔豬的血液分菌結(jié)果顯示，原液組1和1∶10稀釋組仔豬在感染后1～2 d均能分離出Ss3;而1∶100稀釋組仔豬在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未能分離出Ss3。在感染后的第4 d，仍能從有關(guān)節(jié)紅腫癥狀的仔豬關(guān)節(jié)液中分離出Ss3;感染后第7 d對(duì)仔豬進(jìn)行剖檢，所有仔豬的血液及肝、脾、肺、腦中均未分離出Ss3。

2.7.2.2試驗(yàn)二結(jié)果（表3）顯示，本試驗(yàn)中2組仔豬感染后的臨床表現(xiàn)與試驗(yàn)一中的原液組1和1∶10稀釋組基本一致，體溫升高、關(guān)節(jié)紅腫、跛行等癥狀也多在感染后第2～4 d消失。10倍濃縮組有一頭仔豬體溫升高至41.8 ℃，較高體溫持續(xù)至第5 d，并在攻毒后第2 d開(kāi)始食欲廢絕，臥地不起，渾身發(fā)抖，四肢呈劃水狀，至第5 d時(shí)處于瀕死狀態(tài)。感染仔豬的血液分菌結(jié)果顯示，2組仔豬在注射JSHZ菌液后第1～3 d能分離出Ss3。在感染后第5 d，仍能從有關(guān)節(jié)紅腫癥狀的瀕死仔豬關(guān)節(jié)液中分離出Ss3;在感染后第5 d撲殺瀕死仔豬，從其腦組織中能分離到Ss3，從肝、脾、肺中未分離到Ss3;在感染后第7 d剖檢其他仔豬，其血液及肝、脾、肺、腦中均未分離到Ss3。表明JSHZ菌液高劑量（10倍濃縮）處理會(huì)導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，并可能引起豬死亡。

圖4顯示，10倍濃縮組的瀕死仔豬可見(jiàn)心包積液，腦部出血，其他臟器病變不明顯;對(duì)攻毒后第7 d撲殺的其他感染仔豬進(jìn)行剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)心包積液，其他臟器未見(jiàn)明顯病變。組織病理切片顯微觀察結(jié)果（圖5、圖6）顯示，10倍濃縮組的瀕死仔豬腦組織中形成明顯血管套，大腦皮層局部膠質(zhì)細(xì)胞增生;其他感染組仔豬部分可見(jiàn)心臟有局灶性心肌纖維變性壞死，大腦皮層早期局灶性輕微梗死，小角質(zhì)細(xì)胞增多，肝、脾、肺組織未見(jiàn)明顯病理變化。

3討論

在豬鏈球菌33個(gè)血清型中，豬鏈球菌2型（Ss2）最為流行，而且Ss2還是一種重要的人獸共患病原菌。1998-1999年和2005年分別在中國(guó)江蘇省南通市和四川省資陽(yáng)市、內(nèi)江市等地發(fā)生人感染Ss2的疫情[13]。除Ss2外，常見(jiàn)的能引起豬或人感染的豬鏈球菌還有Ss3、Ss9和Ss7[4]，Ss3是北美洲主要的流行血清型，特別是在美國(guó)，Ss3的分離率甚至高于Ss2[14-15]。流行病學(xué)資料顯示，在中國(guó)Ss3也是優(yōu)勢(shì)血清型之一[6-8]。因此，系統(tǒng)開(kāi)展Ss3分離菌的生物學(xué)特性和致病特性研究對(duì)指導(dǎo)豬鏈球菌病的防控非常必要。

本研究從急性死亡豬肺臟中分離到JSHZ菌株和GD7菌株，從健康豬扁桃體中分離到H30菌株，經(jīng)鑒定均為Ss3，3株菌株的菌落特征、菌體形態(tài)及生化特性基本一致，但3株菌株的ST序列分型卻不同，分別屬于ST27型、ST1004型和ST117型。ST27型為Ss3菌株常見(jiàn)的ST型[1]，有學(xué)者曾分離到ST117型的Ss3菌株[10]，也有學(xué)者曾分離到屬于ST117型的Ss2菌株[10]，而ST1004型為本研究最新鑒定和上傳的ST型，說(shuō)明Ss3的ST型呈現(xiàn)多樣性。在生長(zhǎng)特性方面，JSHZ菌株和GD7菌株生長(zhǎng)較快，JSHZ菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為培養(yǎng)后0～5 h，GD7菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為培養(yǎng)后0～3 h;而H30菌株生長(zhǎng)緩慢，沒(méi)有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在生長(zhǎng)平臺(tái)期的活菌數(shù)僅能達(dá)到JSHZ菌株和GD7菌株的9.00%和7.89%，這種生長(zhǎng)能力的差異是否與菌株的致病特性相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然H30菌株對(duì)小鼠的致病性低于JSHZ菌株和GD7菌株，但仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性，說(shuō)明健康豬也可能攜帶有致病性的Ss3菌株，并成為潛在的傳染源。JSHZ菌株、GD7菌株和H30菌株均能引起部分小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，并能在其腦組織中分離到接種的相應(yīng)菌株，表明Ss3可突破小鼠血腦屏障進(jìn)入腦組織。

用JSHZ菌液注射仔豬，可導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)體溫升高、關(guān)節(jié)紅腫、跛行、精神萎靡、食欲減少等典型的Ss臨床癥狀。在感染早期，較高劑量組（每頭仔豬注射菌數(shù)不低于5×107 CFU）仔豬的血液中均能分離到接種的Ss3菌株，表明JSHZ菌株人工感染豬成功。在感染JSHZ菌株后，多數(shù)仔豬的臨床癥狀僅持續(xù)2～3 d，但高劑量（每頭豬注射菌數(shù)為6×109 CFU）注射時(shí)有一頭仔豬出現(xiàn)了豬鏈球菌急性病例中典型的神經(jīng)癥狀，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)明顯出現(xiàn)血管套，大腦皮層局部膠質(zhì)細(xì)胞增生，同時(shí)在其腦內(nèi)分離到Ss3，表明Ss3 JSHZ菌株亦能突破豬血腦屏障。Ss3 能人工感染豬，并能引起豬鏈球菌感染的典型癥狀和病理變化。

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（責(zé)任編輯：王妮）