王勇 張育銘 朱洪磊 馬超 張寶俊

摘要：以羧甲基纖維素鈉為碳源采用搖瓶富集培養(yǎng)、剛果紅染色定性、纖維素酶活性定量分析法從常年堆積枯枝落葉的腐殖土壤中分離出纖維素降解真菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征及多基因聯(lián)合分析對(duì)其分類地位進(jìn)行鑒別，并測(cè)定其降解谷子秸稈的產(chǎn)酶活性。篩選到具有較高產(chǎn)酶能力的纖維降解真菌4株，命名為MX5、DR9、DR12、TR31，4個(gè)菌株分別為籃狀菌屬真菌及多育曲霉、黑曲霉、巴西曲霉，其中DR12菌株分泌的濾紙酶、內(nèi)切葡聚糖（CMC-Na）酶、外切葡聚糖酶活性最高，分別可達(dá)17.35、8.47、16.35 U/mL，TR31菌株分泌的β-葡萄糖苷酶活性可達(dá)24.96 U/mL。4株纖維素降解菌均可滿足秸稈降解過程對(duì)纖維素酶的需求，有良好工業(yè)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌;纖維素酶;多基因聯(lián)合;黑曲霉

中圖分類號(hào)： S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）23-0255-06

農(nóng)作物秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的一類典型固態(tài)廢棄物，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年秸稈資源產(chǎn)出量約為10億 t[1]。在傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，僅有少量的秸稈被綜合利用，大量秸稈被棄置或直接焚燒，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。秸稈還田是目前解決此類問題最直接有效的手段[2-3]。秸稈還田可以有效改善土壤生態(tài)環(huán)境，培肥地力，提高作物質(zhì)量[4-5]。但還田秸稈的降解過程需要多種酶的參與，其中纖維素酶對(duì)促進(jìn)秸稈降解具有重要作用，自然環(huán)境中秸稈纖維素分解菌較少，且產(chǎn)纖維素酶的活性較低，秸稈原位還田分解速度慢，無法為當(dāng)季作物提供肥料，且易給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來不利影響。因此，通過添加外源秸稈降解菌，加快秸稈的原位腐解，是促進(jìn)秸稈原位降解的高效措施[6-7]。馬欣雨等篩選到高效秸稈降解菌NX9、NF6，培養(yǎng)至第 15 d 時(shí)玉米秸稈降解率分別為53.88%、51.36%[8]。于慧娟等報(bào)道，添加菌株z-5后，小麥秸稈降解率10 d內(nèi)可達(dá)47%[9]。胡海紅等通過硅藻土和菌液構(gòu)建的復(fù)合菌劑促進(jìn)了玉米秸稈降解[10]。這些研究都證明，添加外源降解菌，可加快秸稈原位降解速度。本試驗(yàn)以常年堆積枯枝落葉的腐殖土壤為菌源，采用剛果紅染色定性、纖維素酶活性測(cè)定定量分析篩選高效纖維素降解真菌，并通過多基因聯(lián)合分析確定它們的分類地位，同時(shí)采用限制性培養(yǎng)基發(fā)酵并測(cè)定其產(chǎn)酶活性，以期為加快谷子秸稈還田與資源化利用提供有效菌劑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集山西省各地常年覆蓋有枯枝落葉等腐敗物的土壤，并將其裝入滅菌后的采樣袋中，保存于山西省綠色生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，試驗(yàn)開始時(shí)間為2018年9月，試驗(yàn)地點(diǎn)為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。

濾紙培養(yǎng)基：KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eCl3 0.01 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，NaCl 0.1 g，NaNO3 2.5 g，過60目篩的濾紙10 g，1 000 mL水，pH值7.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15 g瓊脂，蒸餾水定容至1 000 mL。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g，蛋白胨 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，酵母膏 0.5 g，MgSO4 0.5 g，羧甲基纖維素鈉15.0 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂 15.0 g，pH值 7.0。該培養(yǎng)基用于剛果紅染色。

發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO3 2.5 g，F(xiàn)eCl3 0.01 g，CaCl2 0.1 g，谷子秸稈木質(zhì)纖維素20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基用于固體發(fā)酵。

真菌基因組DNA抽提試劑盒等試劑耗材購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 纖維素降解菌的分離篩選

取采集的樣品5 g用100 mL無菌水懸浮振蕩 5 min，靜置后取上清液1 mL加入裝有9 mL無菌水的玻璃管中，稀釋10倍。搖勻后，再取1 mL加入裝有9 mL無菌水的玻璃管中，稀釋102倍，按此方法稀釋到109倍。分別吸取100 μL 10、103、105、107、109這5個(gè)稀釋倍數(shù)的樣液涂布于濾紙培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)菌落形態(tài)挑取單菌落反復(fù)純化培養(yǎng)后，利用剛果紅水解圈法對(duì)菌株進(jìn)行初篩;并參考王琳等的纖維素酶活性測(cè)定方法[11]測(cè)定菌株發(fā)酵上清液的濾紙酶（FPA）活性，對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3 纖維素降解菌產(chǎn)酶活力測(cè)定

按照1%的接種量將篩選到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度為30 ℃、濕度為60%的條件下，在恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，從固體發(fā)酵第2天起，每隔24 h參照3，5-二硝基水楊酸法（簡(jiǎn)稱DNS法）測(cè)定各菌株分泌的濾紙酶（FPA）、內(nèi)切葡聚糖（CMC-Na）酶、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡聚糖苷酶活性等。酶活性計(jì)算公式如下：

酶活性=G×N×5.56/h。

式中：5.56為1 mg的物質(zhì)的量（μmol）;G為吸光值對(duì)應(yīng)葡萄糖質(zhì)量（mg）;N為酶液稀釋倍數(shù);h為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.4 纖維素降解菌分類地位鑒定

形態(tài)觀測(cè)：將分離純化的各菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板中，在25 ℃下恒溫培養(yǎng) 7 d后，挑取菌絲置于載玻片上，顯微觀察各菌株菌絲及產(chǎn)孢特點(diǎn)，對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行觀測(cè)。

分子鑒定：參照真菌基因組DNA提取試劑盒說明提取供試各菌株基因組DNA;質(zhì)量檢測(cè)后以各菌株基因組DNA為模板，分別以SSU、ITS、TUB（表1）為引物，建立聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增體系，擴(kuò)增目的片段。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：上游引物（Primer1） 1 μL，下游引物（Primer2） 1 μL，ddH2O 9.5 μL，模板DNA 1 μL，PCR預(yù)混液（Mix） 12.5 μL;反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性 30 s，（48～56 ℃）退火60 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，于10 ℃保存。SSU的退火溫度為 48 ℃，ITS和TUB的退火溫度為56 ℃。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

從GenBank中下載同時(shí)包含有SSU、ITS、TUB基因的其他模式菌株基因序列，參照多基因聯(lián)合分析法[12-13]，用MEGA 7構(gòu)建所篩選菌株3個(gè)組合基因序列的Neighbor-Joining（NJ ）系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌篩選結(jié)果

從分離的36株纖維素降解菌中共篩選到10株具有纖維素降解能力的真菌，菌株的剛果紅染色結(jié)果如圖1所示，其菌落直徑與水解圈直徑如表2所示。其中MX5、DR9、DR12、TR31菌株的水解圈直徑與菌落直徑比值平方分別為2.22、4.09、2.33、2.50，表明其具有較好的纖維素降解能力。進(jìn)一步通過濾紙酶活性測(cè)定復(fù)篩選到MX5、DR9、DR12、TR31 4株高產(chǎn)酶纖維素降解菌，產(chǎn)酶活性可分別達(dá)9.48、17.22、10.26、11.13 U/mL（圖2）。

2.2 纖維素降解菌產(chǎn)生的酶活性

圖3-a表明，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MX5、DR9的CMC-Na酶活性均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，DR12、TR31的CMC-Na酶活性呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。其中DR12菌株在發(fā)酵至第8天時(shí)酶活性達(dá)到最高值，為8.47 U/mL，TR31菌株在發(fā)酵至第10天時(shí)酶活性達(dá)到最高值，為7.70 U/mL，MX5菌株在發(fā)酵至第12天時(shí)酶活性為7.33 U/mL，DR9菌株在發(fā)酵至第12天時(shí)酶活性為 7.84 U/mL，DR12菌株酶活性整體高于其他3株菌株。

圖3-b表明，MX5、DR12、TR31 3株纖維素降解菌隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，濾紙酶活性大體呈先增長(zhǎng)后降低趨勢(shì)，在發(fā)酵至第10天時(shí)酶活性達(dá)到最高值，分別為16.65、17.35、13.60 U/mL。DR9菌株酶活性大體整體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在發(fā)酵至第12天時(shí)達(dá)最高值，為10.76 U/mL，DR12菌株酶活性整體高于其他3株菌株。

圖3-c表明，MX5、DR12這2株纖維素降解菌隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，外切葡聚糖酶活性呈先增長(zhǎng)后降低趨勢(shì)，在發(fā)酵至第10天時(shí)酶活性達(dá)到最高值，

分別為14.64、16.35 U/mL。DR9、TR31 2株菌株的外切葡聚糖酶活性呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵至第12天時(shí)達(dá)到最高值，分別為11.27、14.99 U/mL，DR12菌株酶活性整體高于其他3株菌株。

圖3-d表明，MX5、DR12、TR31 3株纖維素降解菌總體隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，β-葡萄糖苷酶活性呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵至第12天時(shí)酶活性達(dá)到最高值，分別為24.38、 22.12、24.96 U/mL，DR9菌株酶活性在發(fā)酵至第 8天時(shí)達(dá)到最高值，為 16.42 U/mL，TR31菌株酶活性整體高于其他3株菌株。

2.3 纖維素降解菌形態(tài)特征

從圖4、圖5可以看出，MX5菌株的初生菌絲呈白色，培養(yǎng)3 d后有綠色粒狀子囊果產(chǎn)生，菌落逐漸變?yōu)樯罹G色;顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲為無隔菌絲，分生孢子梗呈掃帚狀，孢子呈圓形。DR9菌株的初始菌落呈白色，培養(yǎng)3 d后菌落呈黃褐色絲絨狀;顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲為有隔菌絲，有較長(zhǎng)的分生孢子梗莖，頂囊呈放射狀，產(chǎn)生少量球形孢子。DR12菌株培養(yǎng)2 d后菌落呈白色;培養(yǎng)5 d后菌落變?yōu)楹谏?，中心凸起，呈絲絨狀，產(chǎn)生大量黑色孢子;顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)呈球形，分生孢子頭及分生孢子均呈球形。TR31菌株培養(yǎng)3 d后菌落呈白色;培養(yǎng)7 d后菌落正面呈白色，背面呈淡黃色，菌落絲絨狀平展，有放射狀溝紋;顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲為無隔菌絲，分生孢子梗短有橫隔呈短桿狀，產(chǎn)生少量圓形孢子。

2.4 纖維素降解菌SSU、ITS、BTU序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

由圖6可知，MX5菌株與Talaromyces purpureogenus （KX058136.1）的同源性為100%，DR9菌株與多育曲霉 （Aspergillus proliferans AB002083.1）的同源性為92%，DR12菌株和TR31菌株分別與黑曲霉 （Aspergillus niger HM590646.1）和巴西曲霉 （Aspergillus brasiliensis FJ717695.1）的同源性為85%，結(jié)合菌株形態(tài)特征，并參考姚粟等對(duì)曲霉的描述[14]確定DR12菌株與Aspergillus niger的同源性高，TR31菌株與Aspergillus brasiliensis的同源性高。提交序列后獲得4株菌株的登錄號(hào)，

分別為MT106897、MT106900、MT106901、MT106902。

結(jié)合各菌株的形態(tài)特征，初步將MX5菌株鑒定為藍(lán)狀菌屬真菌，將DR9菌株鑒定為多育曲霉、DR12菌株鑒定為黑曲霉菌、TR31菌株鑒定為巴西曲霉。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)作物秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)出量巨大的可再生能源物質(zhì)，秸稈在田間快速腐解是解決秸稈不合理利用造成的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問題的高效途徑之一[15-16]。廉價(jià)環(huán)保高效的微生物處理方式，一直受研究者們的關(guān)注，其中真菌分泌的纖維素酶含量高，活性較強(qiáng)，已有不少關(guān)于真菌降解秸稈的報(bào)道。許鳳華等篩選到3株纖維素降解真菌QS2、QS6、QW9，它們均具有較高的酶活力[17];向殿軍等篩選到1株纖維素降解真菌CO1，對(duì)玉米秸稈有較好降解效果[18]。本試驗(yàn)篩選到的MX5菌株經(jīng)鑒定與藍(lán)狀菌同源性相近，目前已有關(guān)于藍(lán)狀菌株黃藍(lán)狀菌[19]及圓形藍(lán)狀菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶[20]的報(bào)道，而關(guān)于產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道較少;王加友等篩選到的SY-403藍(lán)狀菌屬菌株產(chǎn)濾紙酶活性為6.87 U/mL[21];Orencio 等測(cè)得Talaromyces stollii LV186菌株產(chǎn)羧甲基纖維素鈉酶活性為12.47 U/mL，與MX5菌株產(chǎn)酶活性相近[22]。DR12菌株產(chǎn)濾紙酶、內(nèi)切葡聚糖（CMC-Na）酶、外切葡聚糖酶活性均總體高于其他3株菌，最高值分別為17.35、8.47、16.35 U/mL，且產(chǎn)酶活性整體趨勢(shì)較平穩(wěn);TR31菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性最高，最高值為24.96 U/mL。4株纖維素降解菌發(fā)酵過程均表現(xiàn)出較高的產(chǎn)酶活性，且產(chǎn)酶高峰有間隔，可滿足秸稈降解過程對(duì)纖維素酶的需求。后續(xù)研究中將以DR12菌株為中心菌株構(gòu)建復(fù)合菌系，開展功能菌株相互作用的研究，開發(fā)針對(duì)谷子秸稈等地域性農(nóng)作物秸稈的腐熟劑。

參考文獻(xiàn)：

[1]石祖梁. 中國(guó)秸稈資源化利用現(xiàn)狀及對(duì)策建議[J]. 世界環(huán)境，2018（5）：16-18.

[2]王長(zhǎng)波，平英華，劉先才，等. 我國(guó)秸稈資源“五化”利用研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（7）：22-26，29.

[3]石祖梁，邵宇航，王 飛，等. 我國(guó)秸稈綜合利用面臨形勢(shì)與對(duì)策研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃，2018，39（10）：30-36.

[4]高 靜，朱 捷，黃益國(guó)，等. 農(nóng)作物秸稈還田研究進(jìn)展[J]. 作物研究，2019，33（6）：597-602.

[5]宋 平. 農(nóng)作物秸稈開發(fā)利用研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代牧業(yè)，2018，2（2）：26-30.

[6]劉 堯，李 力，李 俊，等. 玉米秸稈高效腐解復(fù)合菌系CSS-1的選育及組合分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（21）：4437-4446.

[7]李江頌，李日強(qiáng)，王愛英，等. 固態(tài)發(fā)酵玉米秸稈的菌株組合和發(fā)酵條件研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（8）：1601-1605.

[8]馬欣雨，孫麗娜，盧 珊，等. 秸稈降解菌的篩選及對(duì)秸稈的降解效果[J]. 生物學(xué)雜志，2020，39（4）：1198-1205.

[9]于慧娟，郭夏麗. 秸稈降解菌的篩選及其纖維素降解性能的研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2019，35（2）：58-63.

[10]胡海紅，孫繼穎，高聚林?等. 低溫高效降解玉米秸稈復(fù)合菌系發(fā)酵條件優(yōu)化及腐解菌劑的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（8）：1602-1609.

[11]王 琳，劉國(guó)生，王林嵩，等. DNS 法測(cè)定纖維素酶活力最適條件研究[J]. 河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1998，26（3）：66-69.

[12]Lin Z Y，Wei J J，Zhang M Q，et al. Identification and characterization of a new fungal pathogen causing twisted leaf disease of sugarcane in China[J]. Plant Disease，2015，99（3）：325-332.

[13]Brown J R，Douady C J，Italia M J，et al. Universal trees based on large combined proteinsequence date sets[J]. Nature Genetics，2001，28（3）：281-258.

[14]姚 粟，李 輝，程 池. 23株曲霉屬菌種的形態(tài)復(fù)合鑒定研究[J]. 食品發(fā)酵工業(yè)，2006，32（12）：37-43.

[15]李培培，韓寶文，曹燕篆，等. 一組秸稈分解菌群的穩(wěn)定性及對(duì)還田秸稈的促腐效果[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，16（5）：45-49.

[16]歐陽(yáng)家風(fēng)，劉峙嶸，鄒 翔. 水稻秸稈在土壤-水體系中的腐解性能[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，34（3）：546-551.

[17]許鳳華，翟珊珊，劉婷婷，等. 高效纖維素降解真菌的篩選及粗酶活性[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（21）：7-10，17.

[18]向殿軍，滿莉麗，張春鳳，等. 玉米秸稈纖維素降解菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：1159-1161.

[19]陳 述，李多川，劉開啟，等. 黃藍(lán)狀菌一種幾丁質(zhì)酶的純化、性質(zhì)及抗菌活性[J]. 中國(guó)森林病蟲，2003，22（3）：6-9.

[20]楊晉偉. 小孢盤多毛孢和圓形藍(lán)狀菌次生代謝產(chǎn)物研究[D]. 蘭州：蘭州大學(xué)，2015.

[21]王加友，趙彭年，楊德玉，等. 一株纖維素分解菌的篩選、鑒定及其對(duì)玉米秸稈的降解效果[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展，2018，8（2）：132-139.

[22]Orencio T M，Torres G J，Rangel L A，et al. Cellulase and xylanase production by the Mexican strain Talaromyces stollii LV186 and its application in the saccharification of pretreated corn and sorghum stover[J]. BioEnergy Research，2016，9（4）：1034-1045.孫 藝，郭愛請(qǐng). 石家莊市耕地人口承載力評(píng)價(jià)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（23）：261-269.