趙春燕，龔加順，楊磊幫，王秋萍

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

梁王茶屬（Nothopanax Miq.）系五加科（Araliaceae）的常綠、無(wú)刺灌木或喬木，全世界約有15 種，主要分布于大洋洲，我國(guó)僅有2 種，即掌葉梁王茶[Nothopanax delavayi（Franch.）Harms ex Diels，LWC]和異葉梁王茶[N.davidii（Franch.）Harms ex Diels][1]。梁王茶又稱(chēng)梁旺茶，山檳榔、良旺茶、樹(shù)五加、白雞骨頭樹(shù)等[2]。我國(guó)梁王茶野生資源主要集中在華中、西南、西北地區(qū)，多生長(zhǎng)在海拔350 m～3 000 m，野外生存環(huán)境多數(shù)為山坡、溝谷和竹、林木下或灌木叢中及河邊或路旁[1]。梁王茶是云南白族的藥用植物，白語(yǔ)稱(chēng)作“構(gòu)肌肝”（云龍、劍川）、“構(gòu)肝丘”（洱源）、“武伙”（云龍，意譯：回味、清涼）。藥用全株，味甘、微苦、性涼，具清熱解毒、活血舒筋、止渴、止咳、理氣消食、止痛等功效。白族民間用于治咽喉痛、咳嗽、消化不良、蛔蟲(chóng)、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、腸炎、解煙毒，根用于風(fēng)濕骨痛[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，掌葉梁王茶的根與莖具有較好的鎮(zhèn)痛作用[3]。梁王茶的五環(huán)三萜物質(zhì)具有抗癌抗腫瘤作用、免疫調(diào)節(jié)作用、消炎鎮(zhèn)痛作用、抗病毒抑菌作用以及預(yù)防心腦血管疾病等作用[4]。

目前對(duì)梁王茶的研究主要集中在異葉梁王茶的根、樹(shù)皮等部位的化學(xué)成分分析，對(duì)于掌葉梁王茶的研究極少。在我國(guó)掌葉梁王茶主要分布在云南、貴州、四川、湖南及湖北，尤其是云南海拔1 700 m～3 000 m山谷闊林、混交林或灌叢中[5]。云南省蘭坪縣是掌葉梁王茶生長(zhǎng)的最適宜地區(qū)，當(dāng)?shù)赜袑⑵淠廴~入食的習(xí)俗。采摘梁王茶嫩葉，水洗瀝干后，按照綠茶加工工藝，殺青、揉捻、曬干后制成梁王茶茶葉，沖泡后，其茶香撲鼻，湯色金黃清澈，茶湯過(guò)喉，圓潤(rùn)甘甜。

相關(guān)報(bào)道已對(duì)梁王茶不同部位的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定。庾石山等從異葉梁王茶樹(shù)皮中分離得到2 種五環(huán)三萜皂甙（異葉梁王茶甙III 和IV）、2 種新的三萜皂苷（異葉梁王茶苷Ⅶ和Ⅷ）、梁王茶苷Ⅱ、及5 種新化合物（異葉梁王茶甙Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ）[6-10]。洪化鵬等從異葉梁王茶干葉中分離得到2 種齊墩果烷型三萜及2 種三萜類(lèi)化合物（3β-olean-12-ene-28，29-dioic acid和梁王素A）[11-12]。楊青等從掌葉梁王茶莖皮的70%乙醇提取物中分離得到11 個(gè)化合物，主要為糖苷、糖酯苷[13]。梁王茶新鮮植株有芳香氣味，胡英杰等對(duì)掌葉梁王茶精油的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，其研究結(jié)果鑒定出梁王茶中有月桂烯、萜烯-4-醇、異松油烯、2-環(huán)氧丙烷、1-己醇等42 種化學(xué)成分[14]。洪化鵬等對(duì)異葉梁王茶鮮葉的精油組分進(jìn)行分析，測(cè)得主要成份有月桂烯等11 種，經(jīng)評(píng)香屬花香型精油[15]?？娒髦緩漠惾~梁王茶和掌葉梁王茶的不同藥用部位提取、分離、純化梁王茶多糖，發(fā)現(xiàn)掌葉梁王茶的根中可溶性多糖含量最高，平均為 1.68%[16]。

關(guān)于掌葉梁王茶葉的化學(xué)成分及其抗氧化尚無(wú)報(bào)道，亦無(wú)梁王茶葉速溶茶粉的相關(guān)報(bào)道。因此本研究以掌葉梁王茶葉為原料，采用熱水浸提法制備梁王茶葉速溶粉，比色法研究梁王茶葉及其速溶茶粉的化學(xué)組分及其抗氧化能力，并對(duì)梁王茶葉17 種游離氨基酸進(jìn)行了測(cè)定，旨在為梁王茶的深度開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

掌葉梁王茶茶葉：由蘭坪潤(rùn)民農(nóng)產(chǎn)品有限責(zé)任公司提供。

牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）：生物試劑，上海源葉生物科技有限公司；茚三酮：生物純，上海斯信生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)（G-250）：高級(jí)純，上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、苯酚：分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；濃硫酸：分析純，重慶川東化工有限公司；乙腈：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

Jan-80 離心機(jī)：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；ELX 808 酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰公司；BILON-12 真空冷凍干燥機(jī)：鄭州比朗儀器有限公司；HH-8 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；AR224CN 電子天平：奧豪斯儀器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 梁王茶速溶茶粉的提取工藝

1.2.1.1 梁王茶速溶茶粉提取工藝流程

干茶→粉碎→過(guò)200 目→熱水浸提→過(guò)濾（紗布粗濾，再經(jīng)濾紙抽濾）→減壓濃縮（65 ℃）→真空冷凍干燥→速溶茶粉

1.2.1.2 正交試驗(yàn)

以浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比、提取次數(shù)這4 個(gè)因素為研究對(duì)象，按四因素三水平即L9（43）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and level table of orthogonal design

每組試驗(yàn)均稱(chēng)取20 g 茶葉進(jìn)行浸提，茶粉提取率的計(jì)算為：提取率/%=茶粉質(zhì)量/原料茶葉質(zhì)量×100

1.2.2 梁王茶葉及其速溶茶粉的化學(xué)成分測(cè)定

水溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[17]，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=3.295x+0.003，R2=0.998（其中 x 為牛血清白蛋白濃度（mg/mL），y 為 595 nm 處吸光值）。水溶性氨基酸含量測(cè)定采用茚三酮比色法[18]，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=0.796x-0.005，R2=0.993（其中 x 為谷氨酸濃度（mg/mL），y 為570 nm 處吸光值）。水溶性總糖、多糖含量的測(cè)定采用苯酚硫酸法[19-20]，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=3.041x+0.039，R2=0.995 其中 x 為葡萄糖濃度（mg/mL），y 為 490 nm 處吸光值）。測(cè)定多糖含量時(shí)，茶葉和茶粉的制樣方法分別為：茶葉與水的比例為1 g ∶30 mL，沸水浴浸提30 min，濾紙過(guò)濾，濾液定容至30 mL。取濾液1 mL，加4 mL 無(wú)水乙醇醇沉6 h，3 000 r/min 離心5 min，沉淀加10 mL水溶解即得多糖待測(cè)液；0.025 g 茶粉溶于10 mL 水中，從中取出1 mL 加4 mL 無(wú)水乙醇醇沉6 h，3 000 r/min離心5 min，沉淀加10 mL 水溶解即得多糖待測(cè)液?？偠喾?、總黃酮含量的測(cè)定采用福林酚比色法[21]，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=5.416 1x+0.012，R2=0.997（其中 x 為沒(méi)食子酸濃度（mg/mL），y 為 765 nm 處吸光值）。測(cè)定總黃酮時(shí)，樣品的制樣方法為[22]：于2 mL EP 管中，加入1 mL 測(cè)總多酚的樣品、0.5 mL HCl（濃鹽酸∶水=1 ∶4，體積比）、0.5 mL 35%甲醛，暗處放置24 h 后在3 000 r/min 下離心5 min，沉淀為黃酮，用福林酚法分析上清液中非黃酮含量?？傸S酮含量=總多酚含量-非黃酮含量。游離氨基酸的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.124-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》，采用氨基酸分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）進(jìn)行測(cè)定[23]。

1.2.3 抗氧化活性的測(cè)定

在黑城文書(shū)中，有一件標(biāo)號(hào)為Y1: W 99的文書(shū)提到了儒學(xué)教授楊景仁，他是至正三年(1343)八月接受敕牒，至正四年二月到亦集乃路上任的。[注]前引李逸友編著《黑城出土文書(shū)(漢文文書(shū)卷)》，第123頁(yè)。與這件文書(shū)中提到的“敕受亦集乃路儒學(xué)教授楊景仁”為同一人。該文書(shū)寫(xiě)于至正六年(1346)二月，當(dāng)時(shí)楊景仁已經(jīng)在亦集乃路執(zhí)教整整兩年了。

根據(jù)Wang 等[24]的方法測(cè)定梁王茶葉及其速溶茶粉對(duì)DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除能力。其清除率的計(jì)算方法如下：DPPH 自由基清除率/ %=（ADPPH-A樣品對(duì)照-A樣品）/ADPPH×100，其中 ADPPH為：780 μL 0.094 mmoL/L DPPH+20 μL 超純水；A樣品對(duì)照為：780 μL甲醇+20 μL 樣品；A樣品為 780 μL 0.094 mmoL/L DPPH+20 μL 樣品，將上述溶液混勻，置于暗處放置30 min 后測(cè)得的吸光值。ABTS 自由基清除率/%=（AABTS-A樣品）/AABTS×100，式中 AABTS為 1 mL ABTS 自由基工作液與10 μL 超純水混勻反應(yīng)后，所測(cè)吸光值；A樣品為1 mL ABTS 自由基工作液與10 μL 樣品混勻反應(yīng)后，所測(cè)吸光值。

根據(jù)Heleno 等[25]的方法測(cè)定梁王茶葉及速溶茶粉的還原力，吸光值越大則還原力則越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行Grubbs 檢驗(yàn)，以排除過(guò)失誤差；經(jīng)G 檢驗(yàn)合格的數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0，用鄧肯氏法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梁王茶速溶茶粉提取的最佳條件

梁王茶速溶茶粉提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)比較表2 中的極差R 可知，各因素關(guān)系為D>B>A>C，即對(duì)梁王茶速溶茶粉提取率的影響依次為提取次數(shù)>浸提時(shí)間>浸提溫度>料液比；最佳因素水平組合為A3B3C3D3，即最佳的浸提條件為溫度85 ℃，浸提 60 min，料液比 1 g ∶30 mL，浸提次數(shù) 3 次。按較優(yōu)條件A3B3C3D3，進(jìn)行3 重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，得到梁王茶速溶茶粉的提取率為39.88%。

表2 梁王茶速溶茶粉提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Extraction of instant tea power from LWC leaves by orthogonal test

2.2 梁王茶葉及其速溶茶粉的化學(xué)成分分析

梁王茶葉及其速溶茶粉的化學(xué)成分分析見(jiàn)表3。

由表3 可知，除水分含量外，梁王茶速溶茶粉的各種成分含量均高于茶葉，這是因?yàn)榱和醪杷偃懿璺凼怯闪和醪枞~的水提物，經(jīng)濃縮干燥后所得。梁王茶葉的主要化學(xué)組分含量依次為：水溶性總糖47.32 g/kg＞總多酚13.76 g/kg＞水溶性蛋白質(zhì)9.58 g/kg＞水溶性氨基酸5.91 g/kg＞水溶性多糖1.89 g/kg＞總黃酮0.88 g/kg。梁王茶速溶茶粉的主要化學(xué)組分含量依次為：水溶性總糖236.05 g/kg＞水溶性蛋白質(zhì)99.47g/kg＞水溶性氨基酸30.83 g/kg＞總多酚27.08 g/kg＞水溶性多糖17.99 g/kg＞總黃酮2.03 g/kg。由此可知，除總多酚外，梁王茶速溶茶粉中主要化學(xué)組分的含量高低與其原料梁王茶葉中相似。總多酚含量在梁王茶葉中高于水溶性蛋白質(zhì)和氨基酸的含量，而在梁王茶速溶茶粉中低于水溶性蛋白質(zhì)和氨基酸的含量，這是因?yàn)榱和醪杷偃懿璺凼怯闪和醪枞~水提物濃縮干燥而得，而梁王茶葉中的多酚可能主要為醇溶性多酚。梁王茶葉和速溶茶粉中的水溶性總糖含量均高于其他組分，其中茶葉中水溶性總糖的平均含量為47.32 g/kg，這與繆明志[16]報(bào)道的梁王茶中可溶性總糖的平均含量為60.5g/kg 相近。

表3 梁王茶葉及其速溶茶粉的化學(xué)成分分析Table 3 Chemical compositions of LWC leaves and its instant tea powder

總糖、多糖能夠提供熱能，維持血糖，參與構(gòu)造組織細(xì)胞[26]；蛋白質(zhì)可以增強(qiáng)機(jī)體抵抗力[27]；氨基酸是構(gòu)成茶湯鮮爽滋味的主體成分[24]；多酚是茶湯滋味濃度和湯色的決定因素，但它又是澀味形成的主要物質(zhì)，它的含量如果過(guò)高，則會(huì)明顯的苦澀味，因此，對(duì)品質(zhì)要求來(lái)說(shuō)，多酚含量必須在一個(gè)適當(dāng)?shù)暮糠秶畠?nèi)[28]；黃酮是一類(lèi)具有抗菌、抗炎作用的物質(zhì)[29]。從梁王茶速溶茶粉的主要化學(xué)組分可看出，其營(yíng)養(yǎng)豐富，并含有一定量的多酚、黃酮及多糖等生物活性成分，是一款較為健康的速溶茶飲品。

2.3 梁王茶葉17種游離氨基酸的含量

圖1 梁王茶葉17 種游離氨基酸含量Fig.1 Contents of 17 free amino acids in LWC leaves

由圖1 可知，在梁王茶葉中共測(cè)得17 種游離氨基酸，其含量依次為組氨酸45.74 mg/kg＞天門(mén)冬氨酸29.85 mg/kg＞谷氨酸 14.34 mg/kg＞絲氨酸 11.89 mg/kg＞蘇氨酸8.9 mg/kg＞賴(lài)氨酸7.90 mg/kg＞胱氨酸6.46 mg/kg＞精氨酸4.72mg/kg＞蛋氨酸4.59mg/kg＞脯氨酸4.30 mg/kg＞丙氨酸2.66mg/kg＞纈氨酸1.89 mg/kg＞甘氨酸1.64 mg/kg＞亮氨酸1.30 mg/kg＞絡(luò)氨酸1.13 mg/kg＞苯丙氨酸0.99 mg/kg＞異亮氨酸0.86 mg/kg。組氨酸被認(rèn)為是一種人類(lèi)（主要是兒童）必需的氨基酸，組氨酸也是尿毒癥患者的必需氨酸[30]。

2.4 梁王茶葉及其速溶茶粉的抗氧化活性

梁王茶葉及其速溶茶粉的抗氧化活性如圖2 所示。

圖2 梁王茶葉及其速溶茶粉的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of LWC leaves and its instant tea powder

如圖2A～圖2C 所示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著梁王茶葉濃度增加，其對(duì)DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率，及其還原力均增加，與濃度呈正相關(guān)。梁王茶葉清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的IC50分別為3.92、12.84 mg/mL，表明梁王茶葉對(duì)DPPH 自由基的清除優(yōu)于ABTS 自由基。吸光值越大還原力越強(qiáng)，梁王茶葉的還原力在2 mg/mL～15 mg/mL 范圍內(nèi)隨濃度增加顯著（P＜0.05）；而在 15 mg/mL～50 mg/mL 范圍內(nèi)，還原力增加平緩（P＞0.05）；在15 mg/mL 時(shí)，還原力達(dá)到2.966。

如圖2D～圖2F 所示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著梁王茶速溶茶粉濃度增加，其對(duì)DPPH 自由基和ABTS自由基的清除率，及其還原力均增加，與濃度呈正相關(guān)。梁王茶速溶茶粉清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的IC50分別為1.60、1.36 mg/mL，表明梁王茶速溶茶粉對(duì)ABTS 自由基的清除優(yōu)于DPPH 自由基。梁王茶速溶茶粉在0.1 mg/mL～2 mg/mL 范圍內(nèi)還原力顯著增加（P＜0.05），在 2 mg/mL～3.5 mg/mL 范圍內(nèi)還原力增加不顯著（P＞0.05），在 3.5 mg/mL 時(shí)，還原力為 3.343。梁王茶速溶茶粉是由梁王茶葉水提物濃縮干燥而得，其主要化學(xué)組分含量均高于梁王茶葉。其中梁王茶速溶茶粉的生物活性成分水溶性多糖（17.99 g/kg）、多酚（27.08 g/kg）、黃酮（2.03 g/kg）分別為梁王茶葉的 9.52、1.97、2.31 倍，因此其還原力，及對(duì)DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率均優(yōu)于梁王茶葉。

3 結(jié)論

掌葉梁王茶葉的主要化學(xué)組分依次為水溶性總糖47.32 g/kg＞總多酚13.76 g/kg＞水溶性蛋白質(zhì)9.58 g/kg＞水溶性氨基酸5.91 g/kg＞水溶性多糖1.89 g/kg＞總黃酮0.88g/kg，含量最多的游離氨基酸是組氨酸45.74 mg/kg。以掌葉梁王茶葉為原料，采用熱水浸提法制備梁王茶速溶茶粉，其最佳浸提條件為料液比1 g ∶30 mL，溫度85 ℃，浸提60 min，浸提次數(shù)3 次，此條件下速溶茶粉的提取率達(dá)到39.88%。所得梁王茶速溶茶粉的主要化學(xué)組依次水溶性總糖236.05 g/kg＞水溶性蛋白質(zhì)99.47 g/kg＞水溶性氨基酸30.83 g/kg＞總多酚27.08 g/kg＞水溶性多糖17.99 g/kg＞總黃酮2.03 g/kg。梁王茶葉及其速溶茶粉清除DPPH 自由基的IC50分別為3.92、1.60 mg/mL；清除ABTS 自由基的IC50分別為12.84、1.36 mg/mL。梁王茶速溶茶粉的還原力，及對(duì)DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率均優(yōu)于梁王茶葉。梁王茶速溶茶粉營(yíng)養(yǎng)豐富，并含有一定量的多酚、黃酮及多糖等生物活性成分，有較強(qiáng)的抗氧化能力，是一款較為健康的速溶茶飲品。