本文介紹了益智組織培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀，包括益智組織培養(yǎng)的外植體篩選、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗、移栽等，探討了益智組織培養(yǎng)推廣應(yīng)用的影響因素，并對(duì)益智組織培養(yǎng)的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

益智Alpinia oxyphylla Miq.，別名益智仁、益智子，屬姜科Zingiberaceae山姜屬Alpinia多年生草本植物，是中國(guó)四大南藥（檳榔、益智仁、砂仁、巴戟天）之一。益智果實(shí)益脾胃、理元?dú)?、補(bǔ)腎虛滑瀝，藥用價(jià)值極高。益智生長(zhǎng)于陰濕林下，廣泛分布于海南、廣東、廣西、福建和云南等地[1]。近年來(lái)，林下經(jīng)濟(jì)因投資少、產(chǎn)值高、見(jiàn)效快、省勞力等優(yōu)勢(shì)成為一種農(nóng)業(yè)新興產(chǎn)業(yè)。益智因喜陰等生長(zhǎng)習(xí)性成為廣東、海南、福建等省份的主要林下經(jīng)濟(jì)作物。

傳統(tǒng)的益智種子播種育苗技術(shù)難以滿足種苗需求，而且長(zhǎng)期傳統(tǒng)育種容易造成益智品質(zhì)退化、產(chǎn)量降低，甚至品種變異，抗病蟲(chóng)能力降低，導(dǎo)致某些優(yōu)良品種趨于滅絕[2]。

與傳統(tǒng)的繁殖技術(shù)相比，植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖周期短、成本低及人為可控性高等優(yōu)點(diǎn)，繁殖系數(shù)大，可保留品種優(yōu)良性狀，避免農(nóng)藥及重金屬污染等，已成為應(yīng)用最廣泛的育苗技術(shù)[3]。

1益智外植體篩選及增殖培養(yǎng)

以益智的塊狀莖芽、子葉、葉節(jié)等不同外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選出塊狀莖芽是良好外植體。

將無(wú)菌塊莖莖芽接種到1.2MS+6-BA1.0+ NAA0.1的單芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。15 d左右塊莖莖芽生長(zhǎng)，頂端伸長(zhǎng)，基部膨大，產(chǎn)生少量愈傷組織；在30 d時(shí)觀察，塊莖莖芽頂端伸長(zhǎng)并形成完整單芽，部分側(cè)芽萌發(fā)形成完整單芽，塊莖莖芽基部明顯膨大并伴生少量愈傷組織。朱文麗等[4]對(duì)益智塊莖莖芽進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)基MS+6-BA3.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉膠的培養(yǎng)效果最佳，外植體明顯膨大，愈傷組織質(zhì)地緊密，培養(yǎng)30 d后，愈傷組織可增殖2～3倍。黃梅花等[5]以益智塊莖莖芽、子葉、葉節(jié)等為試驗(yàn)材料，研究益智組培技術(shù)，結(jié)果表明塊莖芽是良好外植體，見(jiàn)圖1。

2外植體消毒

于晴天正午挖取益智未展葉塊莖莖芽，去土去根，在塊莖莖芽苞片與姜塊交界處切斷，保持益智濕潤(rùn)并帶回實(shí)驗(yàn)室；將采集的外植體置于飽和漂白粉溶液中浸泡30 min，用無(wú)菌水洗凈，轉(zhuǎn)移至0.1%升汞溶液處理15 min，使用無(wú)菌水漂洗4次以上，將漂洗干凈的外植體進(jìn)行第二次切割，將塊莖莖芽外層苞片剝離，切除接觸升汞溶液的部分，從中軸縱切成兩半，接種到空白MS培養(yǎng)基。

切下新抽出的塊莖莖芽，用清水洗凈芽上的雜物，用洗衣粉浸泡20 min后，用清水沖洗。在超凈工作臺(tái)上，按常規(guī)方法消毒滅菌，無(wú)菌水沖洗4～5次后，切取長(zhǎng)約1 cm的牙尖，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。將塊莖用清水洗凈后放入已經(jīng)消毒的培養(yǎng)容器內(nèi)，置于超凈工作臺(tái)上，再用75%乙醇表面消毒1 min，再用0.1%（w/v）氯化汞浸泡消毒10 min，最后用無(wú)菌水沖洗3遍，再用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。

3叢生不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將生長(zhǎng)狀況良好的單芽接種取出，在無(wú)菌條件下切除單芽基部愈傷組織，轉(zhuǎn)接至1.2MS+ 6-BA3.0+KT0.6+蔗糖45 g/L的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每30 d轉(zhuǎn)接一代，單芽基部膨大，產(chǎn)生少量不定芽，將原接種單芽縱切為帶一半原單芽及部分不定芽的組織塊，轉(zhuǎn)移至相同培養(yǎng)基，愈傷組織剔除；轉(zhuǎn)接30 d后，組織塊膨大，產(chǎn)生大量不定芽，形成密集的叢生芽。將愈傷組織轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基MS+6-BA6.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉膠上，效果最佳，分化的小芽數(shù)量多且均勻，形成芽叢。適宜的叢生芽分化培養(yǎng)基是MS+6-BA4 mg/L+5%蔗糖+0.6%卡拉膠+0.05%普羅丹葉面肥，見(jiàn)圖2。

4叢生不定芽增殖培養(yǎng)

將獲得的密集叢生芽，切割為帶3～5不定芽的組織塊，接種至叢生芽增殖培養(yǎng)基1.2MS+ 6-BA0.5+KT0.2+蔗糖45 g/L上。在培養(yǎng)過(guò)程中，原接種組織塊體積迅速增加，不定芽形成1.5～2 cm且生長(zhǎng)健壯的叢生芽，叢生芽高速增長(zhǎng)的同時(shí)，基部形成較多的不定芽，實(shí)現(xiàn)迅速增殖，其后每30 d繼代轉(zhuǎn)接1次。將芽叢分切成小芽叢，在培養(yǎng)基MS+6-BA6.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉膠上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，30 d后每個(gè)不定芽基部分化出2～3個(gè)小芽。每30 d繼代1次，2～3代后，不定芽增殖系數(shù)可達(dá)4～6，見(jiàn)圖3。

5壯苗培養(yǎng)

將健壯叢生芽切割為帶有3～5個(gè)健壯單芽的組織塊，接種至壯苗培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基配方為1.2MS+KT0.1+NAA0.1+蔗糖60 g/L。接種后30 d，原接種單芽形成3.0～4.0 cm高度且生長(zhǎng)健壯的單芽，基部不定芽生長(zhǎng)為1.5～2.5 cm高度且生長(zhǎng)健壯的單芽，見(jiàn)圖4。

6生根培養(yǎng)

將獲得的單芽切割分級(jí)，植株高度在3～4 cm的單芽接種生根培養(yǎng)基，植株高度小于3 cm的單芽重新接種至壯苗培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基配方為1.2MS+NAA0.5 mg/L+IBA0.5+甲哌嗡1.0 mg/L，附加90 g/L蔗糖，活性炭0.05 g。生根苗接種后15 d，單芽基部出現(xiàn)5～8個(gè)可見(jiàn)的白色根原突起，后形成粗壯的白色不定根；接種后30 d，不定根萌發(fā)側(cè)根，形成完整的根系。將叢生不定芽分切為單芽，接種于培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.2+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉膠上，1周后抽出不定根，4周后苗高4 cm以上，生根率100%。待苗長(zhǎng)至3～4 c m高度時(shí)移至生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA1 mg/L+6%蔗糖+0.6%卡拉膠+0.25%活性炭+0.1%普羅丹葉面肥上，25 d后即可長(zhǎng)成株高6～8 cm，有2～3蓬葉，2～3條根的小苗，生根率100%，根系旺盛，分支多而細(xì)長(zhǎng)，苗體健壯，見(jiàn)圖5。

7生根苗煉苗

將生根苗帶瓶置于溫室內(nèi)進(jìn)行煉苗，煉苗溫度25～35℃，在晴天9：00～16：30煉苗棚棚頂遮陽(yáng)，其余時(shí)間遮陽(yáng)網(wǎng)全開(kāi)透光，陰雨天全天透光。將瓶苗置于50%蔭蔽度的大棚內(nèi)，煉苗1周。培養(yǎng)30～50 d，根系發(fā)達(dá)，植株高為6～8 cm的益智瓶苗移到溫室，在自然光下閉口煉苗3 d，再置于陰涼通風(fēng)的大棚內(nèi)進(jìn)行開(kāi)蓋煉苗3 d，適時(shí)噴水，以提高瓶苗的適應(yīng)能力，見(jiàn)圖6。

8生根苗移栽

移栽完成后使用亮盾1 500倍液噴濕苗木及基質(zhì)，不澆定根水。移栽后1周，使用噴霧器噴水保濕，在移栽后5 d，噴灑生根水1次，可選擇國(guó)光根盼（萘乙酸？吲哚丁酸）1 000倍液，移栽后10 d，噴灑殺菌劑1次，可選擇25%咪鮮胺乳油800～1 200倍，加入葉面肥。移栽后15 d，進(jìn)行正常容器苗管理流程，禁止積水，同時(shí)避免因干旱導(dǎo)致卷葉甚至死苗。每月使用水溶性復(fù)合肥澆灌1次，濃度為0.2%～0.5%，如苗木生長(zhǎng)過(guò)旺，可噴灑25%丙環(huán)唑乳油2 500倍液1次，在抑制過(guò)快生長(zhǎng)同時(shí)可起到良好地防病作用。將小苗取出試管，用清水洗凈附著在根系上的培養(yǎng)基，再用0.2%多菌靈浸泡20 min后，栽植在裝滿營(yíng)養(yǎng)土（表土∶河沙∶椰糠=2∶2∶1）的營(yíng)養(yǎng)杯中，澆透定根水后覆蓋50%遮蔭網(wǎng)。1周左右，小苗恢復(fù)生長(zhǎng)，以后按照常規(guī)育苗方法管理。試管苗移栽成活率100%。將生根苗移出瓶外，用清水洗凈根部附著的培養(yǎng)基，放入0.1%多菌靈溶液中浸泡消毒10 min，用清水洗凈后移栽到預(yù)先消毒處理過(guò)的河沙中，河沙用營(yíng)養(yǎng)杯分裝，每杯栽種1株，澆水淋透，適當(dāng)保濕遮蔭。15 d噴施1次營(yíng)養(yǎng)液，進(jìn)行常規(guī)管理。30 d后組培瓶苗移栽成活率達(dá)到90%以上，移栽成活率提高10%。曾武等[6]對(duì)益智組培幼態(tài)苗進(jìn)行了分株繁育，育苗時(shí)間為8～12月，選擇取水方便、地勢(shì)平坦、不易積水、背風(fēng)的地方為育苗場(chǎng)，搭建遮光度為75%的簡(jiǎn)易蔭棚；將幼態(tài)苗從原育苗穴盤(pán)中整叢苗拔出后，抖凈根系的輕基質(zhì)，剪掉約1/2葉片，保持植株高不超過(guò)30 cm，將每個(gè)側(cè)芽用利刀分別從母株上先后切下來(lái)，形成單株的分株苗。每個(gè)芽基部都要帶有完整的根系，收集起來(lái)放入保濕的毛巾包好，及時(shí)拿到育苗棚內(nèi)栽入穴盤(pán)中。按照常規(guī)方法做好肥水管理、病蟲(chóng)害防治等，見(jiàn)圖7。

9培養(yǎng)條件

益智組培苗的誘導(dǎo)、分化和增殖生長(zhǎng)不僅需要適宜的培養(yǎng)基，還與溫度、光照、等條件有關(guān)。在益智組織培養(yǎng)時(shí)，溫度25℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1 800 lx較好。

10展望

當(dāng)前，中國(guó)依托藥用植物資源、氣候生態(tài)、政策扶持、中藥市場(chǎng)、中藥文化等優(yōu)勢(shì)，大力開(kāi)發(fā)藥用植物，產(chǎn)業(yè)規(guī)模逐年擴(kuò)大，市場(chǎng)需求旺盛。“四大南藥”之一的益智因其經(jīng)濟(jì)價(jià)值大、市場(chǎng)前景好、效益高等優(yōu)點(diǎn)受到種植戶的歡迎，中國(guó)益智種植產(chǎn)業(yè)正逐漸壯大。益智組織培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，增強(qiáng)了益智育苗的數(shù)量和質(zhì)量，提供了更多優(yōu)質(zhì)的無(wú)性系種苗，提高了益智產(chǎn)量、品質(zhì)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，經(jīng)濟(jì)效益明顯，應(yīng)用前景十分廣闊。

但是，中國(guó)益智種質(zhì)資源混雜，收集保存工作處于初步開(kāi)展階段，優(yōu)良品種選育、鑒定評(píng)價(jià)指標(biāo)、制定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等工作還需要完善。若有些益智品種繁育效果不理想，需再次對(duì)以上技術(shù)進(jìn)行革新。

參考文獻(xiàn)

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[5]黃梅花，張明俊，謝黎黎.益智組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)與裝備，2019（10）：114-115.

[6]曾武，黎建偉，林錦容，等.益智組培幼態(tài)苗分株繁殖技術(shù)[J].熱帶林業(yè)，2019，47（1）：10-11.

基金項(xiàng)目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（No.2016KJCX008、2019KJCX006）。

[廣東茂名市林業(yè)科學(xué)研究所卜蜜源，林思誠(chéng)（通訊作者），王祥，冼世慶，劉付月清]