薛俠，趙皖秋，李偉，李明昭，趙小利，王敏

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003)

近年來，隨著輔助生殖技術(shù)臨床妊娠率的增高，多胎率也居高不下。為了降低多胎率，全球目前形成了提倡單胚胎移植的共識[1]。我中心的多胎率隨著移植胚胎數(shù)的減少，從原來的40.0%下降到目前的15.1%。本中心前期的研究結(jié)果提示，通過優(yōu)化胚胎選擇標準可在不降低臨床妊娠率的同時降低雙胎率[2]。本研究中引進了實時觀察培養(yǎng)箱，通過比較實時觀察培養(yǎng)和三氣培養(yǎng)選擇性單囊胚移植的臨床結(jié)局，為進一步降低多胎率提供參考。

一、資料與方法

1. 研究對象與分組：選擇2015年1月1日至2018年5月31日在本院生殖中心接受常規(guī)輔助生殖治療且獲卵數(shù)≥5個的1 717個單囊胚移植周期。納入標準：獲卵數(shù)5～15個，超長方案或長方案，年齡<35歲。排除標準：排除PGT和IVF-D患者。根據(jù)胚胎培養(yǎng)方式不同，分為實時觀察培養(yǎng)(time-lapse)組和三氣培養(yǎng)(labotac)組。其中實時觀察培養(yǎng)組191個周期，三氣培養(yǎng)組1 526個周期，全部采用形態(tài)學評分選擇單囊胚移植。所有患者均簽署知情同意書。

2. 臨床方案：根據(jù)患者情況選擇合適的促排方案進行控制性促排卵(COS)。

3. 精液處理及受精：采卵當日男方使用手淫法留取精液，采用密度梯度離心和上游法相結(jié)合的方法進行處理，密度梯度離心液采用Pureception 40%及80%(SAGE，美國)，洗滌液為spermrinse(Vitrolife，瑞典)，上游液為G-IVFPLUS(Vitrolife，瑞典)。采用四孔板授精法，每孔加入預平衡好的G-IVFPLUS 0.6 ml上蓋油，注射HCG后39～40 h按照3 500～4 000∶1的比例加入精子和卵母細胞，每孔2枚卵母細胞。精卵共同孵育，5 h后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至G-IVFPLUS孔中脫顆粒放入G1.5(Vitrolife，瑞典)中觀察第二極體排出情況。脫完顆粒隨機分配放入三氣培養(yǎng)箱和實時觀察培養(yǎng)箱。

4. 囊胚培養(yǎng)及囊胚移植：受精16～18 h后觀察雙原核(2PN)，實時觀察培養(yǎng)箱中沒有觀察到2PN的再回放確定受精情況。第三天根據(jù)胚胎質(zhì)量評分，評分1級～3級的胚胎為可用胚胎，其中評分1級和2級的為優(yōu)質(zhì)胚胎。有4個以上優(yōu)質(zhì)胚胎者繼續(xù)用G2.5(Vitrolife，瑞典)囊胚培養(yǎng)至D5。根據(jù)Gardner評分標準進行評分，有優(yōu)質(zhì)囊胚(評分BB及擴張程度為3以上)的選擇行單囊胚移植。

5. 妊娠判斷：臨床妊娠為孕5周B超見孕囊及胎心。

二、結(jié)果

1.一般情況比較：三氣培養(yǎng)組和實時觀察培養(yǎng)組的男方平均年齡[(31.6±4.6)歲 vs.(31.5±4.3)歲]、女方平均年齡[(29.9±3.7)歲 vs.(29.6±3.6)歲]及平均獲卵數(shù)[(12.7±4.0)vs.(12.8±3.0)]比較均無顯著性差異(P>0.05)；而兩組受精率(82.7% vs. 88.0%)、卵裂率(98.8% vs. 97.0%)、正常受精率(67.5% vs. 75.6%)比較均有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

2.臨床結(jié)局比較：實時觀察培養(yǎng)組的可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、移植的優(yōu)質(zhì)囊胚率均顯著高于三氣培養(yǎng)組(P<0.05)；兩組的臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無顯著性差異，但實時觀察培養(yǎng)組數(shù)值上優(yōu)于三氣培養(yǎng)組(P>0.05)(表2)。

表1 兩組一般情況比較[(-±s)，%]

注：與三氣培養(yǎng)組比較，*P<0.05

表2 兩組的臨床結(jié)局比較(%)

注：與三氣培養(yǎng)組比較，*P<0.05

三、討論

目前，全球ART的目標和趨勢是在不降低妊娠率的同時降低多胎率，選擇性移植一枚最有種植潛力的胚胎或囊胚是每個輔助生殖中心追求的目標。Mancuso等[3]研究提出：移植一枚優(yōu)質(zhì)囊胚是最好的選擇。據(jù)報道，單囊胚移植不僅和雙囊胚移植有同樣高的臨床妊娠率，而且在降低多胎率方面有很大優(yōu)勢[4-5]。但如何選擇胚胎，選用何種培養(yǎng)方式等方面的研究報道較少。雖然已經(jīng)有研究報道，使用time-lapse模型軟件評分法選擇D3單胚胎移植，比D5利用傳統(tǒng)的評分方法選擇單囊胚移植的繼續(xù)妊娠率高[6]。但還未見關(guān)于不同培養(yǎng)箱的選擇使用對單囊胚移植臨床妊娠結(jié)局影響的報道。因此，本研究對普通三氣培養(yǎng)和實時觀察培養(yǎng)的臨床妊娠結(jié)局進行研究，探討何種培養(yǎng)箱在選擇性單囊胚移植臨床妊娠結(jié)局方面更有優(yōu)勢。

傳統(tǒng)的胚胎觀察都是在受精后16～18 h把胚胎放在顯微鏡下觀察，但這種觀察方法有很多弊端，如錯過了2PN的觀察時間、沒有辦法回放觀察、胚胎分裂過程中的情況無從得知等。近年來越來越多的研究提出實時觀察培養(yǎng)箱的優(yōu)勢，如不需要把胚胎移至培養(yǎng)箱外觀察，簡化實驗室工作流程、便于培訓帶教，動態(tài)觀察胚胎的分裂過程等，從而更加準確的篩選移植胚胎。

Pribenszky等[7]研究結(jié)果顯示：實時觀察培養(yǎng)箱優(yōu)于普通的三氣培養(yǎng)箱。本研究結(jié)果與其基本一致：實時觀察培養(yǎng)組中的受精率和正常受精率等均顯著高于三氣培養(yǎng)組(P<0.05)。提示進行選擇性單囊胚移植時可以更多選擇在實時觀察培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，能更好地選擇胚胎，從而得到更好的臨床妊娠結(jié)局。

李施施等[8]研究報道，實時觀察培養(yǎng)箱性能比三氣培養(yǎng)箱更穩(wěn)定，優(yōu)胚率更高，有利于獲得更好的妊娠結(jié)局。Sciorio等[9]對比EmbryoScope time-lapse incubator(ES，TL培養(yǎng)箱)和臺式培養(yǎng)箱發(fā)現(xiàn)，雖然在囊胚形成率方面沒有統(tǒng)計學差異，但TL培養(yǎng)箱有更高的優(yōu)胚形成率。Mascarenhas等[10]對出生后代研究發(fā)現(xiàn)，實時觀察培養(yǎng)箱和普通三氣培養(yǎng)箱相比，出生結(jié)局更好。本研究結(jié)果和以上研究結(jié)果基本一致，實時觀察培養(yǎng)組比三氣培養(yǎng)組有更好的可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和移植的優(yōu)質(zhì)囊胚率；臨床妊娠率和流產(chǎn)率雖無顯著性差異，但實時觀察培養(yǎng)箱有優(yōu)于普通培養(yǎng)箱的趨勢。

然而，有研究發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果：三氣培養(yǎng)箱比實時觀察培養(yǎng)箱有更好的胚胎質(zhì)量，更高的囊胚形成率，更高的臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率[11]。徐士儒等[12]的研究發(fā)現(xiàn)胚胎培養(yǎng)微滴內(nèi)的溫度變化以三氣培養(yǎng)箱恢復最快。Swain等[13-14]研究表明，培養(yǎng)的濕度可以幫助減小環(huán)境對胚胎的壓力，而三氣培養(yǎng)箱可以降低培養(yǎng)液的揮發(fā)，降低滲透壓變化對胚胎發(fā)育的影響。但Barberet等[15]的研究表明，新鮮周期使用不同培養(yǎng)箱的種植率沒有明顯差異。

綜上所述，實時觀察培養(yǎng)箱在選擇性單囊胚移植中有一定優(yōu)勢，但還需要隨機、多中心、大樣本數(shù)據(jù)進一步去研究。