邢彥彥，丁海遐，趙瑋，李文*

(1.海軍軍醫(yī)大學附屬第二醫(yī)院上海長征醫(yī)院 生殖中心，上海 200433；2.復旦大學附屬金山醫(yī)院 婦產(chǎn)科，上海 200540)

由于卵巢組織對放化療極為敏感，腫瘤患者的治療常影響卵巢結(jié)構(gòu)和功能，導致年輕癌癥女性不孕[1]。卵巢自體移植可保存癌癥患者女性生育功能，維持性腺內(nèi)分泌功能，在生育力保存方面有其獨特優(yōu)勢[2]。然而，文獻研究表明，卵巢移植后卵泡丟失是卵巢移植的主要局限所在[3]，嚴重制約了卵巢移植技術(shù)的應用和發(fā)展。缺血再灌注損傷是造成移植過程中卵泡丟失的重要原因之一[4]。干細胞在改善缺血性疾病中發(fā)揮著重要作用。許多研究人員已經(jīng)采用脂肪間充質(zhì)干細胞移植，以減少缺血再灌注損傷對心臟、腎臟、肝臟缺血組織的影響[5-7]。因此，本研究擬通過比較卵巢自體移植組與卵巢自體移植+大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose-derived mesenchymal stromal cells，ADMSCs)組中卵巢組織的結(jié)構(gòu)和功能，探究在大鼠卵巢自體移植過程中加入ADMSCs是否會改善大鼠卵巢自體移植效果，提高移植效率。

材料和方法

一、實驗動物

8周齡SD雌性大鼠26只，體重180～200 g，由上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物實驗室提供。大鼠在12 h光照和12 h黑暗循環(huán)標準條件下飼養(yǎng)，并在SPF級動物飼養(yǎng)室中給予充足的食物和水。術(shù)前陰道涂片均有穩(wěn)定動情周期。所用動物實驗操作均經(jīng)上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會審查批準(公衛(wèi)倫審 2019-A018-02)。

二、試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、購自美國Gibco公司；干細胞成骨誘導試劑盒、干細胞成脂誘導試劑盒、間充質(zhì)干細胞檢測試劑盒均購自中國賽業(yè)生物公司；流式細胞儀(CytoFLEX)購自德國MICROM公司。

三、實驗方法

1.實驗分組：將大鼠隨機分成正常對照組、自體移植組、自體移植+ADMSCs組、去勢組(僅用于大鼠血清FSH、AMH水平比較)，每組6只。剩余2只用于大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞取材。

2.大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定：參考文獻[8]，從2只供體大鼠腹股溝脂肪中提取脂肪間充質(zhì)干細胞。大鼠腹股溝脂肪用PBS洗滌后，用剪刀將脂肪組織剪碎，用0.1% I型膠原酶(Gibco，美國)消化60 min，并輕輕攪拌，然后用添加10%胎牛血清(FBS，Gibco，美國)的DMEM培養(yǎng)基進行酶失活并濾除雜質(zhì)。過濾后，樣品在600g下離心5 min，所得沉淀用添加10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞傳代后取第3代細胞通過流式細胞鑒定，使用單克隆抗體抗CD90、CD105、CD34、CD45和CD73抗體(賽業(yè)生物)。粘附細胞被固定并懸浮在PBS中(1×106細胞/ml)。PBS洗滌后，用上述單克隆抗體在4℃培養(yǎng)細胞30 min，并用流式細胞儀進行快速分析。取第3代細胞，分別采用成脂誘導分化培養(yǎng)基、成骨誘導培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)3周后，分別行油紅O染色、茜素紅染色，觀察成脂及成骨效果。

3.卵巢組織自體移植：在自體移植組、自體移植+ADMSCs組，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 ml/100 g，備皮消毒后，雙側(cè)卵巢切除，將卵巢放置在L15培養(yǎng)基中，去除周圍脂肪及輸卵管組織，修剪為2 mm×1 mm ×1 mm大小。找出大鼠一側(cè)腎臟組織，將腎被膜撕一小口，將分離好的卵巢組織推入腎被膜下，為防止組織滑脫輕輕將其放置在距離腎被膜切口較遠處，同法處理對側(cè)。卵巢移植前，自體移植組在移植部位注入50 μl生理鹽水，自體移植+ADMSCSs組注入含有5×104個ADMSCs/50 μl的生理鹽水[9](圖1)。去勢組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，正常對照組大鼠做假手術(shù)處理。

4.卵巢組織HE染色：術(shù)后28 d，自體移植組、自體移植+ADMSCs組大鼠麻醉后取出移植卵巢組織，正常對照組大鼠取出雙側(cè)卵巢組織后，取2 mm×1 mm×1 mm大小，多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度3～4 μm，每個卵巢組織取第5張切片進行HE染色，卵泡計數(shù)。并對卵泡種類及形態(tài)進行分類，分類標準如下：原始卵泡：指單層扁平或扁平與立方混合的顆粒細胞包繞卵母細胞；初級卵泡：指單層立方型顆粒細胞包繞中間的卵母細胞；次級卵泡：指兩層或以上立方型顆粒細胞包繞卵母細胞；竇狀卵泡指兩層以上的顆粒細胞，卵泡內(nèi)有竇腔形成；形態(tài)正常的卵泡：圓形或橢圓形卵泡形態(tài)，顆粒細胞分布均勻，卵母細胞或顆粒細胞未見濃縮核；形態(tài)異常的卵泡：卵泡失去圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，卵母細胞形態(tài)不規(guī)則，核固縮，顆粒細胞排列紊亂、缺失明顯或出現(xiàn)核固縮。為了避免重復計數(shù)，只有卵母細胞核可見的卵泡被計數(shù)在內(nèi)。

A：卵巢組織移植在腎被膜下；B：自體移植后2 d，卵巢組織充血明顯；C：自體移植術(shù)后28 d，卵巢組織表面見新生血管

5.TUNEL熒光染色評價細胞凋亡率：卵巢移植后28 d，應用TUNEL熒光染色技術(shù)，根據(jù)試劑盒(Roche，瑞士)說明書，計算石蠟包埋切片中的DNA損傷率。取各卵巢組織，連續(xù)切片，取第4張切片行TUNEL熒光染色，按照試劑盒說明進行檢測。熒光顯微鏡下正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈綠色。利用Image Por-plus 6.0圖像分析軟件計算陽性細胞百分比，即凋亡指數(shù)(AI)。

6.CD31免疫組化染色：于移植后28 d取卵巢組織，CD31免疫組織化學染色觀察新生血管。取部分切片，梯度乙醇復水，EDTA 抗原修復，山羊血清室溫封閉，用PBS沖洗后一抗孵育：滴加 1∶200的大鼠CD31單克隆抗體(武漢賽維爾生物)于切片上，覆蓋組織，4℃過夜。二抗孵育：滴加1∶100稀釋、HRP標記的山羊抗兔(武漢三鷹生物)工作液孵育，37℃ 30 min，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。鏡下觀察，CD31 陽性染色為棕色，高倍鏡下觀察陽性細胞密度及分布情況。

7.激素水平測定：術(shù)前及術(shù)后28 d，大鼠內(nèi)眥靜脈取血，4℃、3 000g離心10 min，取上清，ELISA測定血清中FSH、AMH的水平。測定方法及步驟按照ELISA試劑盒(上海西唐生物科技)說明書進行。

8.陰道涂片檢查：卵巢移植術(shù)后第7天開始，每日用蘸無菌生理鹽水的棉簽取大鼠陰道涂片，共21次。然后將細胞涂到干凈的玻璃載玻片上，在光學顯微鏡(BX51；Olympus，日本)下放大100倍觀察。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、ADMSCs形態(tài)觀察及鑒定

流式細胞儀檢測顯示，從大鼠腹股溝脂肪中分離培養(yǎng)的ADMSCs膜表面黏附分子CD90、CD105、CD73呈陽性，CD34、CD45呈陰性，并且茜素紅和油紅染色的結(jié)果也表明分離的細胞可以分化成成骨細胞和脂肪細胞，提示分離培養(yǎng)的細胞具有多向分化潛能(圖2)。

二、卵泡計數(shù)

每組12個卵巢組織，每個卵巢組織取第5張切片HE染色后進行卵泡計數(shù)。正常對照組、自體移植組、自體移植+ADMSCs組每張切片平均卵數(shù)分別為：(32.3±2.9)、(21.5±1.7)、(24.8±1.7)個，自體移植組及自體移植+ADMSCs組的卵泡數(shù)均顯著低于正常對照組(P<0.05)，自體移植組的卵泡數(shù)也顯著低于自體移植+ADMSCs組(P<0.05)。各組原始卵泡數(shù)比較，自體移植組及自體移植+ADMSCs組的原始卵泡數(shù)均顯著低于正常對照組(P<0.05)，自體移植組的原始卵泡數(shù)也顯著低于自體移植+ADMSCs組(P<0.05)。各組閉鎖卵泡數(shù)比較，自體移植組及自體移植+ADMSCs組的閉鎖卵泡數(shù)均顯著高于正常對照組(P<0.05)，自體移植組的閉鎖卵泡數(shù)也顯著高于自體移植+ADMSCs組(P<0.05)(表1、圖3)。

A：CD105；B：CD90；C：CD73；D：CD34；E：CD45；F：原代ADMSCs(×100)；G：3代ADMSCs(×200)；H：成骨誘導培養(yǎng)3周茜素紅染色(×100)；I：成脂誘導培養(yǎng)3周油紅O染色(×100)

表1 三組卵巢組織HE染色后卵泡數(shù)比較(-±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與自體移植組比較，#P<0.05

A：正常對照組(×100)；B：自體移植組(×100)；C：自體移植+ADMSCs組(×100)；標尺=500 μm

三、細胞凋亡指數(shù)測定

Tunel熒光染色顯示，3組均觀察到凋亡細胞，以顆粒細胞及卵母細胞凋亡為主(圖4)。正常對照組、自體移植組及自體移植+ADMSCs組凋亡指數(shù)(AI)分別為(2.8±0.3)%、(14.2±2.8)%、(7.0±0.9)%，3組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

四、CD31免疫組化染色

移植后28 d取卵巢組織，CD31染色發(fā)現(xiàn)，自體移植組CD31陽性細胞主要集中在髓質(zhì)部分，而自體移植+ADMSCs組CD31陽性細胞主要集中在黃體及竇卵泡和次級卵泡的顆粒細胞層，自體移植+ADMSCs組CD31陽性細胞分布情況與對照組更加接近，而且，自體移植+ADMSCs組CD31陽性密度顯著高于對照組(P<0.05)(圖5)。

五、血清激素水平

術(shù)前3組大鼠血清FSH、AMH測定，兩兩比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；術(shù)后28 d，去勢大鼠較自體移植組及自體移植+ADMSCs組大鼠血清FSH值升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而AMH降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步比較，移植組+ADMSCs組的FSH低于自體移植組，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，自體移植+ADMSCs組AMH顯著高于自體移植組(P<0.05)(表2)。

A：正常對照組(×200)；B：自體移植組(×200)；C：自體移植+ADMSCs組(×200)

A：正常對照組；B：自體移植組；C：自體移植+ADMSCs組；標尺=50 μm

表2 術(shù)后28 d大鼠血清FSH、AMH水平及動情周期恢復時間比較(-±s)

注：與去勢組比較，*P<0.05；與自體移植組相比，#P<0.05

六、陰道涂片

陰道涂片顯示，術(shù)后去勢大鼠動情周期消失，而自體移植組及自體移植+ADMSCs組大鼠均出現(xiàn)動情周期，表明移植成功。自體移植組大鼠出現(xiàn)動情周期的時間為(12.0±0.8)d，而自體移植組+ADMSCs組為(10.0±0.5)d，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

討 論

卵巢組織移植在生育力保存方面有其獨特優(yōu)勢[10]，如可保存青春期前女性患者的生育功能、可隨時進行而不會延遲腫瘤本身的治療、可保存諸如乳腺癌等激素敏感性腫瘤患者的生育功能、維持女性性腺內(nèi)分泌功能等[11]。卵巢自體移植過程中伴隨著大量的卵泡丟失，原始卵泡數(shù)量是卵巢儲備功能的主要標志，在移植過程中也有大量減少，嚴重縮短了移植物壽命[12]。由于移植物重新建立血供需要3～7 d時間，缺血再灌注損傷造成移植卵巢大量卵泡的丟失，因此，如何快速建立移植物血供，是移植成功的關(guān)鍵。

干細胞具有多向分化潛能，在缺血性疾病中應用廣泛，目前的研究表明，干細胞通過促進血管形成、減輕缺血再灌注損傷，從而減少細胞凋亡而發(fā)揮作用[13-14]。ADMSCs具有來源方便、增殖力強、多項分化潛能及無免疫原性的特點，且研究表明ADMSCs不具有成瘤性，使用安全[13]。參考文獻報道[15]，我們在大鼠卵巢自體移植使用了最低有效干細胞數(shù)量。本研究結(jié)果顯示，在大鼠卵巢自體移植過程中加入ADMSCs后，移植卵巢組織卵泡總數(shù)及原始卵泡數(shù)均較自體移植組增多，細胞凋亡減少；CD31染色提示新生血管密度增高，并且CD31陽性細胞分布與對照組更接近；血清學數(shù)據(jù)顯示，自體移植+ADMSCs組及自體移植組與對照組相比，F(xiàn)SH降低，AMH值上升，且差異有統(tǒng)計學意義。并且，陰道圖片結(jié)果顯示，去勢組周期消失，而自體移植組及自體移植+ADMSC組大鼠均觀察到動情周期，表明自體移植組及自體移植+ADMSC組移植組織存活，移植成功。

總之，本研究結(jié)果表明，大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞可增加移植卵巢血管形成，減少細胞凋亡，從而減少卵泡丟失，改善移植卵巢結(jié)構(gòu)和功能，提升移植效率，延長移植物壽命。