李偉偉，李麗瑋*，閆婭妮，劉茶，劉聰，殷秀榮，胡悅

(1.秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學科，秦皇島 066000；2.秦皇島市婦幼保健院檢驗科，秦皇島 066000；3.秦皇島市第一醫(yī)院男性不育科，秦皇島 066000)

不孕癥是一個全球性問題，不孕夫婦的比例在全世界人口中達到15%。在所有的不孕因素中，男性因素約占50%[1]。近50%的不育夫婦和大約90%的不育男性中存在四種主要精液異常，包括無精子癥、少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥[2]。在這些病例中，弱精子癥是男性不育的主要原因之一，僅次于少精子癥[3]。弱精子癥可以作為一種獨立的疾病存在，也可能與其他精子異常相關或作為綜合征的一部分存在。弱精子癥是精子濃度≥15×106/ml而精子前向運動(PR)<32%。臨床上將病因不明或者發(fā)病機制不清楚的弱精子癥稱為特發(fā)性弱精子癥。臨床治療特發(fā)性弱精子癥無法采取有效的措施，治療效果不理想。因此很多特發(fā)性弱精子癥的患者只能依靠輔助生殖技術。因此深入研究特發(fā)性弱精子癥的發(fā)病機制，會為臨床治療弱精子癥提供有力的依據(jù)。

精子運動相關蛋白包括離子通道、細胞骨架蛋白、細胞信號蛋白及糖酵解蛋白等，研究表明這些蛋白在精子的運動中必不可少。Tektins蛋白包括Tektin-1、Tektin-2、Tektin-3、Tektin-4、Tektin-5，是一組微管相關的細胞骨架蛋白[4]。這些蛋白主要存在于雄性生殖細胞的中心粒、纖毛鞭毛的微管蛋白。國內已有相關報道證明Tektins與弱精子癥相關[5-6]，國外學者Tanaka等[7]也報道Tektin-2在弱精子癥者中表達下降。有學者克隆了人類Tektin-2基因，在睪丸中顯示出特異性表達，并且精確定位于成熟精子的鞭毛中[8]。這種蛋白質的定位及其與精子運動的關聯(lián)使其成為研究弱精子癥病因的良好候選基因。但是目前缺乏關于Tektin-2的多態(tài)性與弱精子癥的相關性的研究。秦皇島身處京津冀地段，是環(huán)渤海地區(qū)重要港口城市。因此我們在秦皇島婦幼保健院生殖中心和秦皇島市第一醫(yī)院男性不育科選取192例特發(fā)性弱精子癥患者作為弱精子癥組、208例精子活力正常的不育男性(女方無不孕癥相關疾病)作為不育癥組和213例精液正常的已生育男性作為正常對照組，研究Tektin-2的多態(tài)性與秦皇島地區(qū)特發(fā)性弱精子癥的相關性。

資料和方法

一、研究對象及分組

2017年5月至2019年8月期間從秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學科、秦皇島市第一醫(yī)院男性不育科首次接受不孕癥咨詢并登記的夫婦中招募了192例特發(fā)性弱精子癥的男性伴侶作為弱精子癥組。另募集208例精子活力正常的不育癥男性作為不育癥組，213例年齡相當?shù)目捎】的行?至少生育一個孩子)作為正常對照組。

納入標準：所有研究對象均為秦皇島本地人，并且從出生至納入研究時一直生活在秦皇島；男方患者年齡均在23～44歲之間。弱精子癥組：男方未生育，精子濃度≥15×106/ml，前向運動精子<32%;不育癥組：男方未生育，精子濃度≥15×106/ml，前向運動精子≥32%；正常對照組：男方已生育，精子濃度≥15×106/ml，前向運動精子≥32%。

排除標準：男方患有已知疾病如隱睪癥、睪丸炎、附睪炎、精索靜脈曲張、輸精管阻塞、及內分泌性腺功能減退，核型異常和Y染色體微缺失也均被排除在研究之外。另外，吸煙、藥物濫用及酗酒的患者也不納入研究。

本研究經秦皇島市婦幼保健院倫理委員會討論通過，所有受試者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. 精液分析：所有受試者均需要禁欲2～7 d，手淫法留取精液于無菌的取精杯內。由專業(yè)技術人員按照第五版WHO標準進行操作，每份精液標本必須重復計數(shù)兩次，取平均值。

2. 提取基因組DNA：采用精子基因組DNA提取試劑盒(北京百奧森泰)提取人精子的總DNA。步驟如下：吸取液化后的精液(1～3)×106至1.5 ml EP管，加入500 μl Solution A，混勻，12 000 rpm，離心1 min。棄掉上清，重復步驟1一次。棄掉上清，EP管底部留取約50 μl Solution A，用移液器吹打均勻。加入600 μl Solution B和10 μl Solution C，用移液器吹打均勻，50℃～65℃孵育20～30 min。加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻至出現(xiàn)白色絮狀物(即精子基因組DNA)。用移液器將白色絮狀物吸入到提前準備好的含有800 μl 75%酒精的EP管中，顛倒數(shù)次；12 000 rpm離心1 min，用移液器吸掉上清，室溫干燥10～15 min；加入200～800 μl的Elution Buffer，50℃～65℃孵育10 min，用移液器吹打均勻，-20℃保存基因組DNA。

3. 基因組DNA的擴增和位點rs12043423測序：基因組DNA提取后寄送上海生工生物工程有限公司進行SNP的測序。Tektin-2引物序列為：F：5′-CAGAGCAAAATGGACAGGAA-3′；R：5′-TAGCGCTTGTCCCCACTTTA-3′。 應用 DNA作為模板，建立 50 μl 聚合酶鏈反應(PCR)體系：模板DNA 1 μl、dNTPs 2 μl、10× PCR Buffer 5 μl、正反向引物各2 μl、Taq 酶 0.5 μl，加去離子水至終體積 50 μl。PCR反應條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s、59℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸8 min，降至4℃保溫。PCR產物均用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。應用美國 ABI310測序儀對純化后的DNA片段進行測序分型，并用Sequence analysis 軟件進行分析。結果比對用SeqMan軟件(測序結果見圖1)。

4. 蛋白突變的預測：使用PolyPhen-2生物信息程序(http：∥genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)進行了錯義突變對蛋白質結構和功能的破壞作用的預測。

三、觀察/分析指標

患者一般資料(年齡、BMI、精液參數(shù))；不同患者組Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點基因型和等位基因頻率，分析相關于特發(fā)性弱精子癥的風險；rs12043423多態(tài)性位點與Tektin-2蛋白表達的關系分析。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般資料比較

三組患者間年齡、BMI、精子濃度、正常形態(tài)率均無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 弱精子癥組精子前向運動率顯著低于其他兩組(P<0.05)(表1)。

二、Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點基因型和等位基因頻率的檢測

rs12043423多態(tài)性位點測序結果見圖1。我們發(fā)現(xiàn)Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點在所有研究對象中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律(表2)；各組的Hardy-Weinberg平衡檢驗結果分別為：正常對照組(χ2=0.121，P=0.728)，弱精子癥組(χ2=0.006，P=0.940)，不育癥組(χ2=0.241，P=0.624)。rs12043423位點的分布在三組中均具有人群代表性。

表1 一般資料比較(-±s)

注：與其他兩組比較，*P<0.05

表2 Tektin-2基因rs12043423位點基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗結果[n(%)]

a：CC基因型；b：CT基因型；c：TT基因型；箭頭示rs12043423位點第136個堿基的測序結果

經卡方檢驗，CC和TT在三組間的分布存在顯著差異(分別為χ2=6.060，P=0.048；χ2=6.146，P=0.046)，而CT在三組間的分布頻率無顯著性差異(χ2=0.952，P=0.621)。弱精子癥組的CC基因型頻率顯著低于正常對照組及不育癥組(P<0.05)，而TT基因型頻率則顯著增加(P<0.05)(表3)。

表3 Tektin-2基因rs12043423(136C>T)的基因型的分布頻率[n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.05

弱精子癥組C等位基因的分布頻率顯著低于正常對照組和不育癥組，而T等位基因的頻率顯著高于正常對照組和不育癥組(P<0.05)。不育癥組和正常對照組比較，不同基因型的分布頻率及等位基因的頻率在兩組間均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 Tektin-2基因rs12043423(136C>T)的等位基因頻率的比較[n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.05

三、Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點與特發(fā)性弱精子癥的危險因素分析

對Tektin-2基因SNP位點單個基因型進行初步分析，以野生型C/C為參照，對雜合型C/T和突變型T/T在正常對照組、不育癥組和弱精子癥組三組間兩兩進行χ2檢驗和發(fā)病風險分析。為便于分析，將基因型多態(tài)性合并為二分類變量，產生遺傳學顯性模型、隱性模型和等位基因三種二分類結果，將其與弱精子癥的發(fā)病風險進行單因素分析。結果表明顯性模型的OR值小于1，進一步表明在Tektin-2基因多態(tài)性的分布中基因型C/C是特發(fā)性弱精子癥發(fā)病的保護因素，而突變型T/T是特發(fā)性弱精癥發(fā)病的危險因素(表5)。

表5 Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點與特發(fā)性弱精子癥的危險因素分析[n(%)]

四、rs12043423多態(tài)性位點與Tektin-2蛋白表達的關系

Tektin-2基因rs12043423位點突變?yōu)殄e義突變，其蛋白質的改變?yōu)镽46C，我們使用PolyPhen-2分析該變體，結果表明可能具有破壞性(圖2)。另外，精氨酸在Tektin-2蛋白的第46位的疏水性與野生型顯著不同，并且如果精氨酸被取代可導致蛋白質結構被修飾。

圖2 PolyPhen2分析預測Tektin-2蛋白R46C的致病性

討 論

弱精子癥已被確定為男性不育的重要因素之一[9]。染色體異常、微生物感染、內分泌紊亂、精索靜脈曲張及自身免疫等因素是弱精子癥較明確的發(fā)病病因，而精子運動缺陷的潛在分子機制仍在很大程度上不為所知。弱精子癥是一種常見于原發(fā)性纖毛運動障礙(PCD)的表型，是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，可能導致精子鞭毛的作用受損[10-11]。Tektins是一種高度保守的鞭毛和睫狀蛋白家族，在哺乳動物中，Tektins存在于睪丸、腦、視網膜和其他含有纖毛細胞的組織中[12-13]。Tektins是一種不溶性的α-螺旋蛋白，與中間絲(IF)蛋白和核纖層蛋白相關，因此認為Tektins可能在纖毛運動中發(fā)揮重要作用[14]。Tektin-2蛋白定位于成熟精子的尾部。其高度保守的序列表明，Tektin-2在鞭毛的形成中具有重要作用[15]。已有研究表明Tektins與弱精子癥具有相關性，許祥等[5]研究中證實在弱精子癥患者的精子中Tektin-2的表達顯著下降。國外學者Bhilawadikar等[16]的研究也表明Tektin-2的水平在活力差的精子中表達顯著下降。另外Zuccarello等[17]報道了Tektin-2的A229V位點的多態(tài)性可能與弱精子癥具有相關性。Zhang等[18]研究了中國四川男性Tektin-2的多態(tài)性與弱精子癥的相關性，但是國內關于Tektin-2的其他的多態(tài)性位點的報道尚少。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)普遍存在于人類的基因組中，平均每500～1 000個堿基對中就有1個。單核苷酸多態(tài)性發(fā)生在編碼區(qū)的概率很小，幾乎為周圍序列的1/5左右。這種發(fā)生在編碼區(qū)的SNP稱為cSNP，主要分兩種：一種是同義cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymous cSNP)，指堿基序列的改變使得的蛋白質序列也發(fā)生改變，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。本研究中發(fā)現(xiàn)的Tektin-2基因的rs12043423(c.136C>T)即為非同義突變也稱錯義突變。蛋白質的改變?yōu)镽46C，精氨酸在Tektin-2蛋白的第46位的疏水性與野生型顯著不同，這可能是影響Tektin-2蛋白結構和功能的原因，進而影響精子的活力。

本研究將人群分為弱精子癥、不育癥和正常對照三組進行比較，發(fā)現(xiàn)弱精子癥組Tektin-2基因的突變位點rs12043423(c.136C>T)的分布頻率與其他兩組存在顯著差異；而不育癥組和正常對照組之間比較，Tektin-2基因的rs12043423(c.136C>T)的分布頻率不存在顯著差異。弱精子癥組rs12043423(c.136C>T)的TT基因型分布頻率較正常對照組和不育癥組均顯著增高(χ2=4.465，P=0.035；χ2=4.109，P=0.043)。結果表明Tektin-2基因的rs12043423位點突變與精子活力相關。正常對照組為精液正常已生育的男性，不育癥組為精液正常未生育的男性，兩組間Tektin-2基因的rs12043423位點的基因分布頻率無顯著差異，表明此突變與男性不育不直接相關。

弱精子癥組和正常對照組比較，Tektin-2基因突變(雜合子[CT]和純合子[TT])的發(fā)生率分別為61.5%和50.2%；TT基因型與弱精子癥的風險因素分析結果為[OR=1.968，95%CI(1.041，3.723)，P=0.035]，表明這種突變可能是弱精子癥發(fā)生的可能風險。弱精子癥與不育癥組比較，Tektin-2基因突變(雜合子[CT]和純合子[TT])的發(fā)生率分別為61.5%和51.5%；TT基因型與弱精子癥的風險因素分析結果為[OR=1.918，95%CI(1.014，3.630)，P=0.043]，同樣表明這種突變可能是弱精子癥發(fā)生的可能風險。

秦皇島地區(qū)地處環(huán)渤海，屬于暖溫帶氣候，受海洋影響較大。目前，這是秦皇島地區(qū)第一個關于Tektin-2基因的SNP與特發(fā)性弱精子癥之間關聯(lián)的研究。本研究結果表明，Tektin-2變體(R46C)可能與特發(fā)性弱精子癥有關，是弱精子癥發(fā)病的危險因素。但是由于樣本量有限，我們應該進一步擴大樣本量分析Tektin-2蛋白的結構和功能，以證明這些變異影響成熟精子的Tektin-2蛋白活性、蛋白質合成和鞭毛損傷。此外，未來的研究包括不同種族和地理來源的受試者，還應進行Tektin-2基因與其他與弱精子癥相關的基因的結合分析。