蘭海霞 春 英 呼格吉樂

1.解放軍第九六九醫(yī)院兒科，內蒙古呼和浩特 010051；2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，內蒙古呼和浩特 010059

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE），是指在圍生期發(fā)生宮內窘迫、產期窒息，引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或者暫停，導致新生兒腦組織中樞神經損傷，發(fā)病率、死亡率較高。有研究發(fā)現(xiàn)促紅細胞生成素（EPO）除促進紅細胞生成外還可以發(fā)揮神經保護作用。EPO是一種含有唾液酸的糖蛋白激素，與促紅細胞生成素受體（EPOR）結合，對神經系統(tǒng)發(fā)揮保護作用[1]。近年來EPO 逐漸開始發(fā)展成為治療各種神經系統(tǒng)疾病的有效藥物[2]，如缺氧缺血性腦病、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森病、創(chuàng)傷性腦損傷和糖尿病神經病變等[3-7]。在缺血性腦損傷后，低氧的刺激使腦組織內EPO 和EPOR 表達增高[8-10]，尤其是對新生兒缺氧缺血性腦病造成的腦損傷及遠期神經預后可能有改善的作用[11]。EPO 對缺氧缺血性腦病的作用是多基因共同作用的結果，目前研究結果尚不一致[12]，而且未在轉錄水平進行深入研究。本實驗通過應用氯化鈷（CoCl2）來構建U251 細胞的缺氧模型，并對缺氧模型進行評價，探討EPO 對缺氧U251 細胞增殖能力的影響，以及EPO 對BMI1 基因在轉錄水平的影響，為研究EPO 在新生兒缺氧缺血性腦病中的神經保護作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

膠質瘤U251 細胞購自中國醫(yī)學科學院上海細胞庫，MEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，批號：8118247）；DPBS（Gibco 公司，批號：8117130）；0.25%胰蛋白酶（Gibco 公司，批號：1854874）；EPO（北京四環(huán)生物制藥公司，批號：20180330）；RNA 反轉錄試劑盒（TOYOBO 公司，批號：721200）；CCK-8 試劑（上海翊圣生物科技公司，批號：C47790）。

1.2 方法

1.2.1 CoCl2構建U251 細胞缺氧模型及評價

將細胞分為對照組和CoCl2組，每組5 個，分別加入終濃度為0、400 μmol/mL 的CoCl2子溶液，每組培養(yǎng)24、48、72 h 后，在酶標儀上（OD450 nm 處）測定各孔吸光度（OD）值，再計算細胞活力值。細胞活力值（%）=（OD 值各加藥組-OD 值空白組）/（OD 值不加藥組-OD 值空白組）×100%。

1.2.2 EPO 對缺氧情況下U251 細胞增殖的影響

將細胞分為CoCl2組和CoCl2+EPO 組，加入不同濃度的EPO（EPO 濃度分別為0、75 U/mL）。每組培養(yǎng)24、48 h后，在酶標儀上（450 nm 處）測定各孔值，再計算細胞活力值，方法同上。

1.2.3 qPCR 法檢測CoCl2組和CoCl2+EPO 組BMI1基因的轉錄水平

1.2.3.1 提取CoCl2組和CoCl2+EPO 組的總RNA，反轉錄為cDNA。按照逆轉錄試劑盒說明進行操作?；靹螂x心，在42℃15 min，98℃5 min 條件下作用20 min后，放入-20℃存放。見表1。

表1 逆轉錄反應體系（μL）

1.2.3.2 qPCR 實驗。本實驗所用到基因的引物均由上海生工生物有限公司合成，將收到后的引物瞬時離心，然后加入10 倍體積的滅菌水稀釋，引物序列。并配制PCR 的體系，在冰盒上操作。見表2～3。將配好的反應體系置于PCR 儀內反應，將反應條件設為：Holding Stage：95℃，1 min 1 個循環(huán)；Cycling Stage：95℃15 s、60℃15 s、72℃45 s 共39 個循環(huán)反應；Melt Curve Stage：65℃5 s、95℃50 s 1 個循環(huán)。

表2 引物序列

表3 PCR 反應體系（μL）

1.2.3.3 計算RQ 值。RQ 值表示某一基因在對照組和實驗組中的表達差異倍數(shù)，各組目的基因的Ct 值減內參基因的Ct 值為△Ct，然后用各實驗組△Ct 減去對照組△Ct 算出△△Ct 值，RQ=2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8 測定CoCl2對U251 細胞增殖的影響

CoCl2組U251 細胞48、72 h 時OD 值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表4。

表4 不同濃度CoCl2處理的細胞在培養(yǎng)不同時間時的OD 值（）

表4 不同濃度CoCl2處理的細胞在培養(yǎng)不同時間時的OD 值（）

注：與對照組同時間點比較，*P ＜0.05

2.2 CCK-8 測定EPO 對缺氧情況下U251 細胞增殖能力的影響

CoCl2+EPO 組U251 細胞24 h 的OD 值為（1.257±0.035），48 h 的OD 值為（1.31±0.081）。與CoCl2組24、48 h 時OD 值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

2.3 qPCR 法檢測CoCl2組和CoCl2+EPO 組BMI1基因的轉錄水平

熔解曲線與熔解峰單一，提示擴增產物單一無非特異性產物，見圖1。以CoCl2組BMI1 mRNA 相對表達量RQ 值為1，CoCl2+EPO 組RQ 值為（2.013±0.269）。CoCl2+EPO 組表達量高于CoCl2組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見圖2。

圖1 BMI1 PCR 擴增圖

圖2 BMI1 PCR 熔解峰圖

3 討論

新生兒缺血缺氧性腦?。℉IE）指圍生期宮內窘迫、產期窒息，導致腦組織中樞神經缺氧缺血而受損害，是新生兒窒息的重要并發(fā)癥，臨床上發(fā)病率和死亡率均較高，是造成兒童殘疾最常見的原因之一，進行早期干預是防治HIE 神經系統(tǒng)后遺癥的有效方法。Lan 等[13]發(fā)現(xiàn)用EPO 治療海馬損傷模型的新生大鼠后，顯著改善了神經行為學表現(xiàn)，避免了海馬損傷誘導的神經元死亡、促進小膠質細胞活化，提示EPO可能是治療缺氧缺血誘導的新生兒腦損傷的有效方法。因此本實驗使用CoCl2建立體外細胞缺氧模型來模擬新生兒缺氧時腦內低氧環(huán)境，研究EPO 對缺氧環(huán)境下神經膠質U251 細胞的保護作用。

CoCl2作為化學低氧誘導劑常常被用來制造缺氧模型，具有穩(wěn)定轉錄因子HIF-1α 和模擬缺氧的作用。CoCl2能夠在鐵的結合中心用鈷代替鐵的脯氨酰羥化酶來降低羥化活性，促進HIF-1α 的生成進而模擬體內缺氧微環(huán)境[14-15]。Zhang 等[16]應用CoCl2構建體外乳腺癌細胞的缺氧模型，發(fā)現(xiàn)CoCl2通過促進HIF-1α 的表達，來抑制細胞的增殖。依據(jù)預實驗的結果和參考文獻，將作用細胞的CoCl2濃度分為0 μmol/mL和400 μmol/mL，分別培養(yǎng)細胞24、48 h 和72 h 后，運用CCK-8 實驗檢測U251 細胞的增殖情況。本研究結果顯示，當CoCl2濃度400 μmol/mL 時能夠抑制U251 細胞的增殖能力，提示缺氧模型構建成功。

EPO 是由多肽和糖基構成，是一種單鏈的酸性糖蛋白。EPO 發(fā)揮生理作用時需要與EPOR 結合，通過JAK2 及其他信號通路促進紅細胞與血管生成和作用于紅系祖細胞增殖、分化和成熟等。EPO 和EPOR 在人類、嚙齒類動物的大腦中廣泛分布。Traudt 等[17]發(fā)現(xiàn)，EPO 對缺氧缺血引起的腦損傷能有重要的神經保護作用。本實驗將一定濃度EPO 加入到U251 細胞CoCl2缺氧模型中培養(yǎng)細胞，并采用CCK-8 法檢測。結果顯示，75 U/mL 的EPO 能夠促進缺氧條件下U251 細胞的增殖，發(fā)揮神經保護作用。

BMI1 基因由9 個外顯子和9 個內含子組成，是多梳基因家族（PcG）的重要成員之一。在體內通過與c-myc 蛋白共同作用，抑制INK4a 位點，從而調控細胞增殖[18]。BMI1 基因在胃腸道間質瘤組織中的表達增加，表達量與胃腸道間質瘤的危險度分級相關，增殖基因Cyclin Dl 的表達，抑制凋亡基因caspase-7 的表達[19]。BMI1 基因與位于中樞和周圍神經系統(tǒng)中的神經干細胞的自我更新密切相關。BMI1 基因缺陷的神經干細胞自我更新能力下降，神經干細胞細胞周期蛋白依賴激酶抑制基因p16Ink4a 上調，神經干細胞增殖速度下降，同時細胞數(shù)量也隨時間逐漸下降。干擾p16Ink4a 基因的表達，使神經干細胞重新獲得自我更新能力。這些發(fā)現(xiàn)提示，BMI1 基因能夠抑制p16Ink4a基因，提高神經干細胞的自我更新能力[20]。本研究結果顯示，在缺氧條件下EPO 能夠提高U251 細胞的增殖能力并促進BMI1 的表達，提示EPO 可能通過上調BMI1 的表達來實現(xiàn)對神經細胞的保護作用。

本研究使用CoCl2成功構建U251 細胞缺氧模型，外源性給予EPO 處理缺氧環(huán)境下的U251 細胞，發(fā)現(xiàn)EPO 可以促進缺氧環(huán)境下神經膠質U251 細胞的增殖，并且可以上調BMI1 的轉錄水平。提示EPO 可能通過上調BMI1 的表達來實現(xiàn)對神經細胞的保護作用。此外，進一步闡明EPO 對缺氧神經細胞的保護作用，為EPO 在HIE 治療中的作用提供有意義的分子基礎機制，為治療HIE 提供新思路。