潘惠麗，李曉珺，曹龍輝，邱淑嫻，歐永康，姚燕婷

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510303；2.廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院，廣東佛山 528216）

黃酒是中國(guó)最古老的釀造酒，廣東黃酒是我國(guó)黃酒的一個(gè)重要分支。廣東黃酒主要采用優(yōu)質(zhì)糯米和紅曲釀造而成，是嶺南一帶客家人釀造的傳統(tǒng)發(fā)酵型黃酒，具有獨(dú)特的風(fēng)味。傳統(tǒng)的廣東黃酒糖度偏高，不符合人們對(duì)保健養(yǎng)生的追求，而新型的低糖型黃酒口感清淡、糖度較低，更能順應(yīng)時(shí)代發(fā)展的需求。傳統(tǒng)黃酒的釀造主要依靠添加外源白酒控制糖化和發(fā)酵平衡，酵母無(wú)法在耐高滲的環(huán)境中生長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵醪液中糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率不高，酒精產(chǎn)率較低[1]。因此，篩選出一株耐高糖酵母菌株對(duì)解決黃酒偏甜膩問(wèn)題具有十分重要的意義。

目前，耐高糖酵母的選育采用高糖選擇性富集技術(shù)，為此可以初步篩選出具有耐糖度的酵母菌株，再通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)[2]、梯度馴化[3]、紫外誘變[4-5]、復(fù)合誘變[6]等技術(shù)手段進(jìn)行耐高糖酵母菌株的選育，但現(xiàn)有的耐高糖酵母的研究均是針對(duì)其耐高糖酵母菌株發(fā)酵特性及發(fā)酵產(chǎn)物性質(zhì)，將篩選出的耐高糖酵母應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的研究并不多見(jiàn)，而酵母菌發(fā)酵性能的優(yōu)異對(duì)黃酒的風(fēng)味、口感起重要作用，因此篩選得到的具有優(yōu)良發(fā)酵性能的酵母菌株可作為理想的發(fā)酵劑用于黃酒的釀造生產(chǎn)中[7]。

試驗(yàn)從蜂蜜、葡萄、面包[8-10]中提取天然酵母菌，通過(guò)梯度馴化和紫外誘變選育，最終得到耐高糖的酵母菌株，對(duì)其耐受特性和發(fā)酵性能進(jìn)行研究，并將其初步用于黃酒釀造中，以期提高糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率、降低黃酒偏甜膩的口感，為廣東低糖型黃酒的釀造工藝提供了一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棗花蜂蜜，產(chǎn)自福建省福州市；牛油排包，產(chǎn)自廣東省深圳市；黑夏葡萄，產(chǎn)自云南省建水市；葡萄糖（固體）、瓊脂粉、生理鹽水、無(wú)菌水、酒精。

YEPD培養(yǎng)基（酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基）[11]：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH值6.5±0.2，于115℃下高壓滅菌20 min。如用固體培養(yǎng)基，則加入20 g的瓊脂。

高糖液體培養(yǎng)基[12]：分別配制10，20，30，35，40，50，60°Bx的YEPD培養(yǎng)基（只改變培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度），于115℃下滅菌20 min，冷卻待用。

TTC上層培養(yǎng)基[13]：葡萄糖5 g/L，瓊脂15 g/L，TTC 0.5 g/L。

TTC下層培養(yǎng)基[13]：葡萄糖10 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，瓊脂20 g/L，pH值5.5～5.7，于115℃下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[4]：葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸銨1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂1 g/L，于115℃下滅菌20 min。

1.2 儀器

顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，常州市衡正電子儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱爐，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司產(chǎn)品；分光光度計(jì)，上海佐科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；手持折光儀，上海電物理光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母的提取

取適量的3種樣品，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后，分別裝入已滅菌的含有60～75 mL的糖度為10°Bx葡萄糖液的250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，靜置于28℃條件下培養(yǎng)3 d，3 d后取下層液體20 mL轉(zhuǎn)接入含新鮮的10°Bx葡萄糖液的錐形瓶，同等條件下培養(yǎng)相同時(shí)間，完成第2次酵母富集，同理完成第3次酵母富集[3]。

取3個(gè)樣品的第3次的富集液，分別做10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7等 7 個(gè)稀釋度，取10-3，10-4，10-5，10-6稀釋度的試管中的液體，移液接入YEPD瓊脂培養(yǎng)基中涂布稀釋，每個(gè)稀釋度共做3組平行試驗(yàn)并進(jìn)行空白對(duì)照，倒置平板，放置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，觀察酵母菌形態(tài)，并用顯微鏡觀察細(xì)胞特征。

1.3.2 酵母菌的梯度馴化

選取11個(gè)符合酵母菌形態(tài)特征且菌落生長(zhǎng)狀況較好的酵母菌菌落，在YEPD瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離，每個(gè)樣品做3組，劃線后的菌株置于28℃下培養(yǎng)48 h，觀察菌株的形態(tài)與生長(zhǎng)情況。

在劃線分離培養(yǎng)的菌株中篩選出10個(gè)生長(zhǎng)狀況良好的菌種進(jìn)行劃線分離，重復(fù)劃線至生長(zhǎng)出單個(gè)菌株后接入YEPD斜面固體培養(yǎng)基，于28℃下培養(yǎng)48 h，低溫保藏備用[14]。

采用逐步提高培養(yǎng)液糖濃度的方法進(jìn)行梯度馴化。將平板篩選階段挑取的單菌落轉(zhuǎn)接入含10°Bx葡萄糖的YEPD液體試管培養(yǎng)基中，置28℃條件下培養(yǎng)3 d，3 d后從各試管中分別吸取0.1 mL的菌懸液，再次轉(zhuǎn)接入新鮮的含10°Bx葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基試管中，28℃條件下培養(yǎng)3 d，如此重復(fù)3次。10°Bx糖濃度馴化試驗(yàn)結(jié)束后，同樣步驟先后在20～60°Bx的YEPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行酵母菌的馴化處理[3，12]。

1.3.3 梯度馴化后還原糖含量的測(cè)定

采用李環(huán)等人[15]測(cè)定還原糖含量的DNS法對(duì)梯度馴化后的YEPD液體培養(yǎng)基中還原糖含量進(jìn)行測(cè)定，可得到準(zhǔn)確性符合分析要求的還原糖含量，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定馴化后培養(yǎng)基中還原糖含量[16]，初步得到一批耐高糖度的酵母菌株，保藏菌種待用。

1.3.4 酵母的紫外誘變

選取初步得到的耐高糖酵母菌株，在90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入5 mL制備好的酵母菌懸液進(jìn)行紫外誘變處理。誘變參數(shù)[4]為紫外燈15 W，照射距離20 cm，處理時(shí)間為30，40，50，60，70 s。

1.3.5 誘變后耐高糖酵母的篩選

（1）耐糖試驗(yàn)。取誘變后的酵母菌懸液，分別接種于 35，40°Bx的YEPD培養(yǎng)基與 35°Bx的YEPD瓊脂培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)3～4d，觀察誘變后菌株的形態(tài)與生長(zhǎng)情況。用手持折光儀測(cè)其殘?zhí)橇浚Y選出生長(zhǎng)狀況良好且殘?zhí)橇康偷慕湍妇N。

（2） 產(chǎn)酒精特性測(cè)定。接種上述YEPD培養(yǎng)基中的菌液劃線至TTC下層培養(yǎng)基，于28℃恒溫箱中培養(yǎng)1 d，倒入TTC上層培養(yǎng)基，繼續(xù)黑暗培養(yǎng)2～3 h后觀察平板菌落顏色。TTC能與酵母代謝產(chǎn)物結(jié)合發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色由淺紅色至深紅色，產(chǎn)酒精能力越強(qiáng)的菌株顏色越紅[13]。利用TTC平板顯色反應(yīng)可以初步判定酵母菌的產(chǎn)酒精能力，選擇菌落顏色為深紅的酵母菌株用于下一步試驗(yàn)。

（3）產(chǎn)氣能力測(cè)定。將上述篩選出的菌株按5%的接種量接種到帶有杜氏小管的YEPD培養(yǎng)基試管中，于28℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，每隔2 h觀察1次杜氏小管內(nèi)充氣情況，當(dāng)氣體填滿杜氏小管時(shí)停止觀察，選擇出氣體充滿杜氏小管時(shí)間較短的的菌株[4]。

（4） CO2失重測(cè)定。將經(jīng)過(guò)產(chǎn)氣能力測(cè)定的菌種，接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔1 d稱量并記錄數(shù)值。計(jì)算培養(yǎng)基發(fā)酵液減少的質(zhì)量，當(dāng)前后2 d培養(yǎng)基發(fā)酵液的質(zhì)量差值小于0.2 g時(shí)，可以判斷為發(fā)酵完成，停止培養(yǎng)[4]。

1.3.6 酵母菌株的耐受性試驗(yàn)

（1）酒精耐受性能測(cè)定。在每根滅菌后冷卻至室溫的YEPD培養(yǎng)基試管中分別加入乙醇，使培養(yǎng)基的酒精度分別為6%，8%，10%，12%，14%，16%Vol，再分別將最終篩選的待試菌株接種到試管中，于28℃下恒溫培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)36 h后測(cè)定并記錄OD600nm值。

（2）耐酸性能測(cè)定。將YEPD培養(yǎng)基中pH值分別調(diào)至1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，滅菌后冷卻至室溫，再分別將最終篩選的待試菌株接種到培養(yǎng)基中，放置在28℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，36 h后測(cè)定并記錄OD600nm值。

（3）高糖耐受性能測(cè)定。將YEPD培養(yǎng)基滅菌后冷卻至室溫，將培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別調(diào)至30%，35%，40%，45%，50%，55%，再分別將最終篩選的待試菌株接種到試管中，放置在28℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，36 h后測(cè)定并記錄OD600nm值。

1.3.7 耐高糖酵母發(fā)酵性能試驗(yàn)

黃酒生產(chǎn)的一般流程如下：選擇糯米為原料→洗米、浸米→蒸飯→攤飯→加入紅曲、麥曲、酒藥拌曲搭窩→加入水、酵母等進(jìn)行前發(fā)酵處理→后發(fā)酵→過(guò)濾澄清→煎酒→滅菌→成品黃酒。

按照上述工藝完成黃酒前發(fā)酵流程，在前發(fā)酵第2天分別加入0.5g傳統(tǒng)黃酒酵母與誘變菌種，測(cè)定糖度和酒精度；發(fā)酵第7天后再次測(cè)定其糖度和酒精度，進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然酵母鏡檢的形態(tài)觀察

篩選10個(gè)菌株的顯微鏡觀察形態(tài)見(jiàn)表1。

表1 篩選10個(gè)菌株的顯微鏡觀察形態(tài)

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)篩選出菌落生長(zhǎng)狀況良好的培養(yǎng)基，得到10個(gè)符合酵母菌生長(zhǎng)特點(diǎn)的培養(yǎng)基。其中從葡萄中提取的菌落為乳白色，邊緣整齊規(guī)則，有明顯隆起，菌落面積小；從面包與蜂蜜中提取的菌株菌落為乳白色，邊緣不整齊，有微小波浪形曲折，無(wú)明顯突起，菌落面積大。挑取上述菌落進(jìn)行顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，3種來(lái)源的菌株呈卵圓形或圓形，符合酵母菌細(xì)胞的形態(tài)特征。該形態(tài)分析結(jié)果與王昌魁、李偉安等人[3，12]對(duì)酵母菌形態(tài)分析的結(jié)果相同，由此可以判斷3種來(lái)源的菌株為酵母菌株。

2.2 酵母菌梯度馴化結(jié)果

將篩選出的10株酵母菌株，10-3面包、10-4面包、10-3葡萄1.1、10-3葡萄1.2、10-4葡萄2.1、10-4葡萄2.2、10-5葡萄、10-6葡萄、10-4蜂蜜3.1、10-4蜂蜜3.2，將其分別編號(hào)為MB-1.1，MB-2.1，PT-1.1，PT-1.2，PT-2.1，PT-2.2，PT-3.1，PT-4.1，F(xiàn)M-1.1，F(xiàn)M-1.2。梯度馴化后，在糖度為10，20，30°Bx的培養(yǎng)基中均有酵母菌的生長(zhǎng)，在40°Bx的培養(yǎng)基中酵母菌生長(zhǎng)緩慢，菌落面積小，且測(cè)得的殘?zhí)桥c原培養(yǎng)液中糖度相差不大甚至不變，而在糖度為50，60°Bx的培養(yǎng)基中酵母菌基本不生長(zhǎng)。因此，通過(guò)梯度馴化可以得到耐受糖度為30°Bx的酵母菌株。

通過(guò)DNS法測(cè)得的殘?zhí)橇?。葡萄糖的濃度與吸光度存在一定的線性關(guān)系，測(cè)定得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液其回歸方程為Y=11.446X-0.011 3，R2=0.999 2，線性關(guān)系良好。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液見(jiàn)表2，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

按1.3.3測(cè)定殘?zhí)牵玫奖?的數(shù)據(jù)。可得到各個(gè)樣品溶液的吸光值與所測(cè)得的還原糖含量，原培養(yǎng)液中的還原糖含量為0.138 2 mg/100 mg，各個(gè)樣品酵母菌株分解葡萄糖能力為52.5%～92.9%，其中PT-2.2的還原糖含量為0.009 8 mg/100 mg，含糖量最低，因此該菌株的還原糖分解利用率最高。根據(jù)測(cè)定所得樣品的還原糖含量，發(fā)現(xiàn)FM-1.1，MB-1.1，MB-2.1，PT-1.2，PT-2.2這5個(gè)菌株具有較低的還原糖含量。因此，篩選得到耐糖度較高的FM-1.1，PT-2.2及MB-1.1這3個(gè)酵母菌株，用于下一步的紫外誘變育種篩選。

樣品溶液的吸光度與還原糖含量見(jiàn)表3。

表3 樣品溶液的吸光度與還原糖含量

2.3 耐糖與產(chǎn)酒精特性試驗(yàn)結(jié)果

紫外誘變后的酵母菌株經(jīng)過(guò)耐糖性試驗(yàn)，可在35°Bx的YEPD培養(yǎng)基和YEPD瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，而在40°Bx的YEPD瓊脂培養(yǎng)基上酵母菌的生長(zhǎng)情況較差；在產(chǎn)酒精試驗(yàn)中，得到的菌種均為深紅色，無(wú)明顯差別，即菌株都有較好的產(chǎn)酒精性能。對(duì)35°Bx的YEPD培養(yǎng)基中酵母菌進(jìn)行糖度測(cè)定。

不同菌種35°Bx培養(yǎng)基的殘?zhí)橇恳?jiàn)表4。

表4 不同菌種35°Bx培養(yǎng)基的殘?zhí)橇?g·L-1

由表4可看出，PT-2.2紫外馴化40 s，F(xiàn)M-1.1紫外馴化40 s，MB-1.1紫外馴化50 s的菌種殘?zhí)橇孔钌伲贤庹T變的最優(yōu)時(shí)間為40～50 s。將上述3個(gè)殘?zhí)橇孔钌俚木攴謩e編號(hào)為PT-2.2-40，F(xiàn)M-1.1-40，MB-1.1-50，用于下一步酵母菌株發(fā)酵特性檢測(cè)試驗(yàn)。

2.4 產(chǎn)氣能力測(cè)定結(jié)果

產(chǎn)氣能力見(jiàn)圖2。

由圖2可知，按5 h的產(chǎn)氣量排序，順序大小為FM-1.1-40＞PT-2.2-40＞MB-1.1-50，且 3 個(gè)菌株都可在10 h充滿小管。根據(jù)排氣量測(cè)定結(jié)果，F(xiàn)M-1.1-40與PT-2.2-40這2個(gè)酵母菌株的產(chǎn)氣能力更強(qiáng)。

2.5 CO2最大失重的測(cè)定結(jié)果

CO2最大失重見(jiàn)圖3。

由圖3可知，CO2失重隨時(shí)間變化呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，各酵母菌株的CO2最大失重依次為 FM-1.1-40＞PT-2.2-40＞MB-1.1-50，其中前3 d，每日的CO2最大失重呈線性相關(guān)，其斜率可以反映失重的速度，因此每日CO2最大失重速率的菌株依次為FM-1.1-40，PT-2.2-40，MB-1.1-50，最終發(fā)酵結(jié)束后各個(gè)菌株的失重依次為4.8，4.6，4.5 g?？梢?jiàn)各個(gè)菌株的CO2最大失重相差不大，同時(shí)用于下一步的耐受性試驗(yàn)。

2.6 酒精耐受性測(cè)定結(jié)果

酵母耐酒精試驗(yàn)見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，酵母菌的生長(zhǎng)活力受酒精度的影響，隨著酒精度的提高而逐漸下降，當(dāng)酒精度大于10%Vol時(shí) FM-1.1-40，PT-2.2-40，MB-1.1-50 菌株的生長(zhǎng)均受到了抑制，而FM-1.1-40菌株的抑制程度略小于PT-2.2-40菌株和MB-1.1-50菌株，因此其耐酒精的能力比其他2個(gè)菌株要高，在酒精度為7%Vol時(shí)3個(gè)菌株的耐受度都表現(xiàn)良好。

2.7 耐酸性能的測(cè)定結(jié)果

酵母耐糖試驗(yàn)見(jiàn)圖5。

酵母菌最適pH值一般在4.5～5.5，此范圍的酸性環(huán)境下酵母菌有著較強(qiáng)的發(fā)酵能力，但當(dāng)酵母菌在過(guò)低pH值的情況下其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制作用。

由圖5可知，PT-2.2-40菌株，F(xiàn)M-1.1-40菌株，MB-1.1-50菌株在pH值2.5～4.0時(shí)均能正常生長(zhǎng)，但當(dāng)pH值≤2.0時(shí)，其生長(zhǎng)受到一定的抑制，幾乎停止生長(zhǎng)，而FM-1.1-40受抑制程度會(huì)比其他2個(gè)菌株的低，因此其耐酸性的能力較強(qiáng)。

2.8 高糖耐受性測(cè)定結(jié)果

酵母耐糖試驗(yàn)見(jiàn)圖6。

由圖6可知，PT-2.2-40菌株，F(xiàn)M-1.1-40菌株，MB-1.1-50菌株在含糖量為25%時(shí)生長(zhǎng)速度是比較快的，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加時(shí)各菌種的生長(zhǎng)均會(huì)受到一定的抑制，糖度越高，生長(zhǎng)速度越慢，F(xiàn)M-1.1-40菌株在葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高的過(guò)程中受到抑制的程度略小于其他2個(gè)菌株。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到45%的時(shí)候，菌株停止生長(zhǎng)。綜合上述結(jié)果，最終通過(guò)篩選得到FM-1.1-40酵母菌株作為黃酒釀造過(guò)程中的發(fā)酵菌株。

2.9 誘變菌種與傳統(tǒng)菌種黃酒發(fā)酵試驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果

葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)比見(jiàn)表5，酒精度對(duì)比見(jiàn)表6。

表5 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)比

表6 酒精度對(duì)比

將篩選出的FM-1.1-40酵母菌株與傳統(tǒng)酵母同時(shí)應(yīng)用到黃酒釀造過(guò)程，對(duì)比發(fā)現(xiàn)前發(fā)酵第7天FM-1.1-40酵母菌株利用糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精的能力比傳統(tǒng)酵母的能力要高，可知馴化的酵母較傳統(tǒng)酵母具有更優(yōu)的降糖產(chǎn)酒精能力，后期將繼續(xù)探究耐高糖酵母菌株應(yīng)用于黃酒的釀造工藝的研究，進(jìn)而生產(chǎn)一批低糖黃酒產(chǎn)品。

3 結(jié)論

以蜂蜜、葡萄、面包3種原料進(jìn)行酵母菌富集菌株，通過(guò)梯度馴化與紫外誘變相結(jié)合的手段選育耐高糖且發(fā)酵特性優(yōu)良的酵母菌株，經(jīng)過(guò)相關(guān)性能研究獲得具有耐高糖性能的酵母菌株FM-1.1-40，其最大耐受糖度為40%，耐受酒精度為10%Vol，可在pH值1.5的條件下生長(zhǎng)。將篩選出的耐高糖酵母菌株應(yīng)用到黃酒釀造過(guò)程中，糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化率提高11%，酒精度提高0.5%。因此，耐高糖酵母在黃酒降糖關(guān)鍵技術(shù)方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可考慮進(jìn)一步應(yīng)用于黃酒工業(yè)化的釀造過(guò)程。