梁宇碩 陳穎盈 蔡潭溪 季 萍 胡 曄 程齊儉 王 穎

(上海市免疫學(xué)研究所，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025)

結(jié)核病(Tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引起的慢性傳染性疾病。根據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)結(jié)核病報(bào)告指出，我國(guó)在2017年約有90萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核，結(jié)核患病人數(shù)僅次于印度，高居全球第二位[1]。同時(shí)，近年來(lái)隨著多重耐藥結(jié)核患病人數(shù)的增加，各類(lèi)結(jié)核病合并其他疾病(如艾滋病、糖尿病)的出現(xiàn)，對(duì)我國(guó)結(jié)核病的診斷和治療提出了新的挑戰(zhàn)[2]。但是，由于結(jié)核病病灶的空間特征，使其診斷和監(jiān)控難，雖然細(xì)菌學(xué)檢查(痰培養(yǎng)及痰涂片)是結(jié)核病臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)周期長(zhǎng)、靈敏度較低，且假陰性多，目前臨床上僅有32%的肺結(jié)核是通過(guò)細(xì)菌學(xué)確診的[1]。而在抗結(jié)核治療中，即便在治療前細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性的患者，往往在強(qiáng)化期結(jié)束后其痰培養(yǎng)或痰涂片結(jié)果也已經(jīng)轉(zhuǎn)陰，但其臨床病征并未消失，所以在結(jié)核病檢測(cè)和治療監(jiān)察中，痰液中結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)結(jié)果不甚理想[3]。

結(jié)核分枝桿菌感染宿主后，經(jīng)過(guò)呼吸道到達(dá)肺泡，并感染定植于肺泡的巨噬細(xì)胞[4]。感染的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)主要組織相容性抗原分子提呈M.tb抗原到T細(xì)胞，激發(fā)T細(xì)胞產(chǎn)生特異性更強(qiáng)的抗結(jié)核適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5]，T細(xì)胞可以通過(guò)分泌干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-2等多種細(xì)胞因子激活或募集更多炎癥細(xì)胞對(duì)抗M.tb感染[6-8]。目前，基于結(jié)核感染過(guò)程中的免疫細(xì)胞分泌IFN-γ功能所建立的干擾素釋放實(shí)驗(yàn)也成為目前臨床上結(jié)核病重要的輔助診斷手段。但是該方法一方面很難區(qū)分結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染，同時(shí)其對(duì)于結(jié)核病治療過(guò)程中的診斷意義也需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，而其中核心的未解決的問(wèn)題在于目前尚不能確定不同患者在治療過(guò)程中抗原特異性IFN-γ分泌水平與結(jié)核病原菌荷載之間的關(guān)系。

最近，基于Protein A磁珠免疫沉淀富集聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)外周結(jié)核特異性抗原方法的建立為結(jié)核合并艾滋病患者診斷提供新方法。該方法利用Protein A磁珠免疫沉淀富集了患者血漿中由結(jié)核分枝桿菌分泌的特異性抗原CFP-10酶切后的短肽1593(肽段：TDAATLAQEAGNFER;質(zhì)荷比m/z 1593.75)，并通過(guò)引入同位素標(biāo)記的目標(biāo)肽段降低抗原抗體結(jié)合效率的誤差，最后通過(guò)質(zhì)譜分析方法檢測(cè)目標(biāo)抗原的含量[9]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)在無(wú)艾滋病毒感染的結(jié)核病患者中，1593的檢出與定量在結(jié)核病的快速診斷中起著重要的作用[10]。因此，該方法有效提高了M.tb檢出效率，并具有較高的特異性，為檢測(cè)患者在抗結(jié)核治療過(guò)程中病原學(xué)特征提供新方案。目前，該方法是否可用于檢測(cè)結(jié)核病治療過(guò)程中外周抗原的動(dòng)態(tài)變化還未知曉。

為此，本研究擬同步分析活動(dòng)期結(jié)核病患者在抗結(jié)核治療過(guò)程的外周M.tb抗原水平與抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析，一方面為結(jié)核病治療中的免疫動(dòng)態(tài)變化提供病原學(xué)基礎(chǔ)，另一方面也為抗結(jié)核治療監(jiān)控提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來(lái)源 本研究共納入40例活動(dòng)性結(jié)核病患者，患者均來(lái)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，所有患者同意并簽署知情同意書(shū)?；颊呷虢M時(shí)間2012年10月至2016年5月。結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為微生物學(xué)檢查M.tb涂片或者M(jìn).tb培養(yǎng)陽(yáng)性，同時(shí)結(jié)合病史、癥狀、體征、影像學(xué)檢查(X射線或CT)等輔助診斷以及住院期間的抗結(jié)核治療效果確診。其中年齡大于80歲的患者，合并了乙肝、艾滋病等其他感染性疾病的患者均予以剔除；同時(shí)部分入組的患者跟蹤遺失或樣本遺失，最終有6例患者完整收集了治療前及治療中1、2、4、5、6個(gè)月的25例外周血樣本用于本研究分析，并記錄患者痰培養(yǎng)、痰涂片信息、臨床癥狀和病情的轉(zhuǎn)歸。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料、試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、淋巴細(xì)胞分離液均購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司；丙二醇甲醚酸樹(shù)脂(PMA)和離子霉素(ionomycine)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；96孔U底板購(gòu)自美國(guó)BD公司；Pacific Blue-鼠抗人CD3、Perc P-鼠抗人CD8、FITC-鼠抗人IFN-γ抗體、PE-鼠抗TNF-α抗體和細(xì)胞破膜試劑盒均購(gòu)自BD Bioscience公司；碳酸氫銨(pH7.8)、甲酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；特異性增強(qiáng)胰蛋白酶購(gòu)自Promega公司；1593特異性多克隆抗體和1593同位素標(biāo)記肽段(質(zhì)荷比1,603.6)均購(gòu)自GenScript公司；Dynabeads-Protein A磁珠和Crosslinker均購(gòu)自Thermo Fisher。

1.2方法

1.2.1人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 取結(jié)核病患者外周血5 ml，肝素抗凝，收集血漿保存于-80℃，并經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離獲得PBMCs，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后，重懸于含10% FBS、氨芐青霉素和硫酸鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至工作濃度。

1.2.2血漿的酶切 在0.1 ml血漿中加入0.4 ml 10-7mol/L的碳酸氫氨溶液，加入10 μg胰蛋白酶進(jìn)行酶切。渦旋振蕩，溶液充分混勻后，1 200 W微波爐設(shè)置為20%火力，均勻加熱5 min，重復(fù)此加熱步驟6次。微波酶切后，將樣本置入37℃恒溫?fù)u床中混勻孵育16～20 h。

1.2.3Dynabeads-Protein A磁珠的活化和1593特異性抗體的連接 取200 μl磁珠于Ep管中，磁力架上棄上清。加入500 μl PBST(pH=7.4；PBS加0.05% Tween-20)，渦旋混勻后，在磁力架上棄上清。活化后的磁珠與50 μg 1593特異性抗體在200 μl PBS 37 ℃孵育30 min后，500 μl PBST重懸洗滌2次。洗滌后，磁珠用200 μl PBS重懸備用。

1.2.4抗體與Dynabeads-Protein A磁珠的化學(xué)連接 超純水配置含0.02 mol/L磷酸鈉和0.15 mol/L氯化鈉(pH=7.4)的溶劑一和含1 mol/L Tris 鹽酸(pH=7.5)的溶劑二。備用磁珠用500 μl溶液一洗滌2次。洗滌后，磁珠與500 μl稀釋至0.5 mol/L的BS3室溫孵育30 min后加入25 μl溶劑二終止反應(yīng)。PBST(PBS加0.05% Tween-20)洗滌磁珠2次。磁珠用200 μl PBS重懸備用。

1.2.5抗體連接的Dynabeads-Protein A磁珠預(yù)處理及與樣本孵育 200 μl 1% 甲酸與交聯(lián)后的磁珠在室溫下共孵育15 min。置于磁力架上棄上清，加入500 μl PBST洗滌1分鐘，渦旋混勻后棄上清。重復(fù)洗滌3次。磁珠用200 μl PBST重懸。同時(shí)將20 μl 磁珠和2.5 nmol/L的1593同位素肽段(1603)加入酶切后的樣品，充分混勻后在4℃搖床中孵育16～20 h。孵育后磁珠置于磁力架上，棄上清。加入 500 μl PBST洗滌1 min，充分混勻后，棄上清。重復(fù)洗滌2次。加入500 μl PBS洗滌1 min，充分混勻后，棄上清。重復(fù)洗滌3次?？焖匐x心后，置于磁力架上，棄上清。20 μl 1% 甲酸洗脫磁珠上的目標(biāo)肽段。離心，將上清轉(zhuǎn)移到新的Ep管中。21 130 g離心20 min，室溫。將上清轉(zhuǎn)移至新Ep管中。重復(fù)離心1次。上清轉(zhuǎn)移至液相質(zhì)譜上樣管中。三重四極管高效液相色譜儀檢測(cè)樣本，經(jīng)過(guò)Skyline進(jìn)行分析，同時(shí)抗原肽反應(yīng)性=目標(biāo)肽段(1593)/同位素標(biāo)記肽段(1603)，以減少批次間的誤差。

1.2.6胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè) 將PBMCs以1×106個(gè)/200 μl每孔接種于96孔U底板中，分別加入PMA/IONO(陽(yáng)性對(duì)照)和抗原(CFP-10)進(jìn)行刺激，其中PMA/IONO組培養(yǎng)6 h，并同時(shí)加入Golgi Stop；抗原刺激組于37℃培養(yǎng)20 h，培養(yǎng)結(jié)束前6 h加入Golgi Stop。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，先行使用Pacific Blue-鼠抗人CD3抗體和Perc P-鼠抗人CD8抗體進(jìn)行表面標(biāo)志染色，于4℃避光孵育30 min后，用FACS buffer(含2% FBS的PBS)洗滌2遍，加入破膜固定劑，4℃孵育20 min；破膜洗滌液洗滌2次，加入工作濃度的FITC-鼠抗人IFN-γ和PE-鼠抗人TNF-α抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色，4℃避光孵育30 min；破膜洗滌液洗2次，用PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，并采用Flow Jo軟件分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析用Microsoft Excel，Graphpad 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)性分析運(yùn)用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1結(jié)核患者臨床用藥及治療信息 目前我國(guó)抗結(jié)核治療主要采取規(guī)范化的治療方案，即前2個(gè)月為四藥聯(lián)用的加強(qiáng)期(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)，4個(gè)月兩藥聯(lián)用的鞏固期(異煙肼、利福平)[11]。根據(jù)臨床診斷，在本次入組的6例患者中，1例患者在治療6個(gè)月后結(jié)束治療，1例患者在治療7個(gè)月后結(jié)束治療，余下4例患者的治療周期均大于或等于9個(gè)月(表1)。6例患者在治療前的痰培養(yǎng)陽(yáng)性為5例，1例為陰性；經(jīng)過(guò)2個(gè)月強(qiáng)化期治療后痰培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，并直至治療結(jié)束(表2)。

表1 6例跟蹤患者臨床用藥信息

Tab.1 6 tracked TB patients clinical medication information

No.0 month1 month2 months4 months6 months7 months8 months9 months1HRZEHREHREHREND2HREHREHREHRHRHRHREND3HRZEHRZEHRZEHRHREND4HRZEHRZEHRZEHREHRHRHREND5HRZEHRZEHRHRHRHRHRHR6HRZEHRZEHREHRHRHRHREND

Note：H.Isoniazid;R.Rifampin;Z.Pyrazinamide;E.Ethambutol.

2.2結(jié)核患者治療過(guò)程中的外周結(jié)核特異性抗原CFP-10含量的動(dòng)態(tài)變化 在本研究中，我們通過(guò)Dynabeads-Protein A磁珠富集結(jié)核病跟蹤患者外周血漿中結(jié)核特異性肽段，并利用高效液相色譜法分析CFP-10肽段與同位素標(biāo)記肽段的反應(yīng)性(圖1A)，結(jié)果顯示，1～5號(hào)結(jié)核病患者在治療前CFP-10 的水平相當(dāng)，但是在治療過(guò)程中的變化趨勢(shì)不盡相同，其中患者1和患者4的結(jié)核特異性抗原水平隨著治療的進(jìn)程，均有明顯下降；其他4例患者的抗原水平在治療6個(gè)月后仍然處于相當(dāng)?shù)乃剑憩F(xiàn)為下降并不明顯，其中患者6的外周CFP-10的水平在整個(gè)治療過(guò)程中均處于較高水平(圖1B)，上述結(jié)果表明外周血漿中結(jié)核菌抗原在治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化均在個(gè)體差異。

表2 6例患者治療過(guò)程中痰涂片結(jié)果

Tab.2 6 patients with sputum smear results during treatment

No.0 month2 months6 months1+--2+--3+--4+--5---6+--

Note：+.Sputum smear positive;-.Sputum smear negative.

2.3結(jié)核患者治療過(guò)程中CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化 早前的研究發(fā)現(xiàn)在抗結(jié)核過(guò)程中，CD4+T細(xì)胞是主要的抗感染免疫效應(yīng)細(xì)胞[12]， Th1型細(xì)胞能通過(guò)分泌IFN-γ發(fā)揮抗感染作用。本研究通過(guò)流式細(xì)胞法分析患者PBMCs中結(jié)核特異性抗原CFP-10刺激下IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)量的百分比，結(jié)果顯示CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的比例變化與CFP-10在外周血漿中的含量相似，在治療過(guò)程中呈現(xiàn)不同程度的浮動(dòng)。與CFP-10的動(dòng)態(tài)改變相似，患者1和患者4的IFN-γ+Th1細(xì)胞比例在治療早期就呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，患者2和患者5中的IFN-γ+Th1細(xì)胞比例在治療早期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是隨著治療的進(jìn)行，則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而患者3和患者6的IFN-γ+Th1細(xì)胞比例的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)不明顯(圖2B)，上述結(jié)果提示IFN-γ+Th1細(xì)胞比例在結(jié)核治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化同樣具有個(gè)體差異性。

2.4結(jié)核患者治療過(guò)程中的CFP-10含量的變化與CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例的相關(guān)性分析 我們通過(guò)分析抗結(jié)核治療過(guò)程中M.tb特異性CFP-10在外周血漿中的動(dòng)態(tài)變化與CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平與結(jié)核菌抗原在外周的變化趨勢(shì)具有部分一致性(圖3A)，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩者存在顯著性相關(guān)(P<0.05)。

2.5結(jié)核患者治療過(guò)程中CFP-10特異性TNF-α分泌CD4+T細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化 TNF-α是重要的炎癥因子，在抗結(jié)核感染過(guò)程中，TNF-α能通過(guò)誘導(dǎo)已吞噬M.tb的巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗感染作用。我們通過(guò)流式細(xì)胞法分析患者外周PBMCs中CFP-10刺激下TNF-α+CD4+T細(xì)胞比例的動(dòng)態(tài)變化(圖4A)，結(jié)果顯示：患者1和患者6的TNF-α+CD4+T細(xì)胞的比例在治療初期大幅度下降，并在治療3個(gè)月后維持在較低水平；患者2的CD4+T細(xì)胞分泌TNF-α的水平在治療初期有明顯上升，但在治療3個(gè)月后呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)；余下3例患者的TNF-α+CD4+T細(xì)胞比例的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)不明顯(圖4B)。上述結(jié)果提示了TNF-α+CD4+T細(xì)胞比例在結(jié)核治療過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化同樣具有個(gè)體差異性。

圖1 肺結(jié)核患者治療過(guò)程中血漿游離CFP-10的動(dòng)態(tài)變化

Fig.1 Dynamics of CFP-10 burden in peripheray of TB patients receiving anti-TB treatment

Note: A.Representitive of Skyline's analysis of CFP-10 in the peripheray of TB patients receiving anti-TB treatment;B.Dynamics of CFP-10 burden in the peripheray of TB patients receiving anti-TB treatment.

圖2 結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的比例變化Fig.2 Dynamics of IFN-γ releasing CD4+T cell in TB patients receiving anti-TB treatmentNote:A.Representitive of IFN-γ producing CD4+T cells by flow cytometry;B.Dynamics of IFN-γ+CD4+T cell in TB patients receiving anti-TB treatment.

圖3 結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中CFP-10和CFP-10特異性IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的比例變化Fig.3 Dynamics of CFP-10 burden and CFP-10 specific IFN-γ+CD4+T cell percentage in TB patients receiving anti-TB treatmentNote:A.Dynamics of CFP-10 burden and corresponding CFP-10 specific IFN-γ+CD4+T cell percentage during anti-TB treatment in 6 active TB patients;B.The correlation between CFP-10 burden and CFP-10 specific IFN-γ+CD4+T cell percentage in TB patients receiving anti-TB treatment.

圖4 結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中CFP-10特異性TNF-α+CD4+T細(xì)胞的比例變化Fig.4 Dynamics of TNF-α+CD4+T cell in TB patients receiving anti-TB treatmentNote:A.Representitive of TNF-α producing CD4+T cells by flow cytometry;B.Dynamics of TNF-α+CD4+T cell of TB patients receiving anti-TB treatment.

圖5 結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中CFP-10和CFP-10特異性TNF-α+CD4+T細(xì)胞的比例變化Fig.5 Dynamics of CFP-10 burden and CFP-10 specific TNF-α+CD4+T cell percentage of TB patients receiving anti-TB treatmentNote:A.Dynamics of CFP-10 burden and corresponding CFP-10 specific TNF-α+CD4+T cell percentage during anti-TB treatment in 6 active TB patients;B.The correlation between CFP-10 burden and CFP-10 specific TNF-α+CD4+T cell percentage in TB patients receiving anti-TB treatment.

2.6結(jié)核患者治療過(guò)程中CFP-10含量的變化與CFP-10特異性TNF-α+CD4+T細(xì)胞比例的相關(guān)性分析 分析CFP-10含量的變化與CFP-10特異性TNF-α+CD4+T細(xì)胞比例的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在患者治療期間TNF-α+CD4+T細(xì)胞的比例與CFP-10含量的變化趨勢(shì)并不一致(圖5A)，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，釋放TNF-α的CD4+T細(xì)胞比例與外周血中M.tb的含量變化無(wú)相關(guān)性(P>0.05，圖5B)。

3 討論

結(jié)核病的治療過(guò)程中，結(jié)核菌荷載可以直接反映患者接受抗結(jié)核治療的有效性，而機(jī)體內(nèi)抗結(jié)核免疫反應(yīng)水平的動(dòng)態(tài)變化則是間接的生物標(biāo)志，在以往的研究中，尚沒(méi)有關(guān)于兩者之間相關(guān)性的直接證據(jù)。本研究則利用高靈敏度的高效液相色譜測(cè)定了患者在抗結(jié)核治療中M.tb特異性抗原CFP-10的動(dòng)態(tài)變化，并同步測(cè)定了CFP-10特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的動(dòng)態(tài)改變，以此獲得了機(jī)體內(nèi)CFP-10特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平和抗原荷載的相關(guān)性，以期為抗結(jié)核細(xì)胞免疫應(yīng)答水平提供病原學(xué)依據(jù)。

本研究納入的6例結(jié)核病患者均接受規(guī)范化的DOTS治療方案，即前2個(gè)月四藥聯(lián)用的加強(qiáng)期(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)，和4個(gè)月兩藥聯(lián)用的鞏固期(異煙肼、利福平)，并根據(jù)疾病臨床表現(xiàn)決定是否延長(zhǎng)。對(duì)在此治療過(guò)程中外周CFP-10抗原肽的檢測(cè)結(jié)果顯示，CFP-10含量在抗結(jié)核治療過(guò)程中的變化趨勢(shì)在個(gè)體間差異較大，包括有持續(xù)下降(患者1和4)，逐步上升(患者2和5)和基本持平(患者3和6)等三種情況。事實(shí)上，治療前和治療過(guò)程中目前常規(guī)的菌培養(yǎng)的檢測(cè)方法只能定性，而非定量，而本研究中的方法則可以實(shí)現(xiàn)外周病原抗原更好的定量。在本研究中患者6在治療前的抗原水平明顯高于其他患者，但是在臨床上目前的檢測(cè)方法很難獲得類(lèi)似的結(jié)果。此外，在治療過(guò)程中CFP-10抗原肽的動(dòng)態(tài)變化在個(gè)體間的差異也可能與患者藥物治療后病原菌釋放的抗原在人體內(nèi)的持留有關(guān)。

已有的研究充分表明CD4+T細(xì)胞作為抗結(jié)核免疫應(yīng)答的重要組成[13]，在藥物治療過(guò)程中的免疫動(dòng)態(tài)變化特征則可以很好地反映病原菌的清除[14]。我們分析了6例患者在抗結(jié)核治療前和治療1、2、3、4、5、6個(gè)月過(guò)程中分泌IFN-γ和TNF-α的CD4+T細(xì)胞比例的動(dòng)態(tài)變化后，結(jié)果顯示：不同的細(xì)胞因子在治療過(guò)程中分泌水平的變化趨勢(shì)不完全相同。在抗結(jié)核治療6個(gè)月后，CD4+T細(xì)胞中上述兩個(gè)細(xì)胞因子的水平在5例患者中都有不同程度的減少；而在余下的1例患者中，兩個(gè)細(xì)胞因子均有不同程度的增長(zhǎng)。

機(jī)體在結(jié)核菌的刺激下能活化T細(xì)胞釋放IFN-γ和TNF-α等多種細(xì)胞因子，發(fā)揮抗感染作用。這些細(xì)胞因子在結(jié)核病的發(fā)展和治療中能誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的免疫學(xué)效應(yīng)[15]。IFN-γ作為一種重要的結(jié)核應(yīng)答細(xì)胞因子，可以進(jìn)一步激活單核巨噬細(xì)胞，促使巨噬細(xì)胞活化并產(chǎn)生一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)殺滅結(jié)核分枝桿菌[16]。研究發(fā)現(xiàn)，3例患者IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的比例在前期治療中有顯著性下降；而在有治療2月前(治療前和治療1個(gè)月)數(shù)據(jù)的5例患者中，4例患者的Th1細(xì)胞在治療2個(gè)月時(shí)有顯著性回升。隨著抗結(jié)核治療，結(jié)核特異性抗原的變化趨勢(shì)與Th1細(xì)胞的水平有一定的相關(guān)性。

TNF-α可以通過(guò)募集免疫細(xì)胞聚集和黏附形成肉芽腫，隔離結(jié)核分枝桿菌感染區(qū)域；TNF-α能誘導(dǎo)已吞噬結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞凋亡，激活炎癥介質(zhì)。但TNF-α作為促炎細(xì)胞因子，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的控制有雙向作用，有研究發(fā)現(xiàn)高水平的TNF-α?xí)p少對(duì)結(jié)核分枝桿菌活性的抑制作用，加重患者病情[17]。隨著結(jié)核病情加重，TNF-α水平也隨之升高[13]。因此，TNF-α在抗結(jié)核治療中有著重要地位，或許能成為療效鑒別的重要生物指標(biāo)。我們的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α+與IFN-γ+CD4+T細(xì)胞水平在治療期間的反復(fù)性變化不同，TNF-α+CD4+T細(xì)胞的比例在6例患者中有4例隨著治療過(guò)程有顯著降低，提示了TNF-α在抗結(jié)核中的保護(hù)作用。而其與外周CFP-10抗原含量之間的無(wú)相關(guān)性則提示TNF-α+CD4+T細(xì)胞的水平可能還有抗原以外的其他因素影響。

綜上所述，本研究通過(guò)高靈敏度的高效液相色譜測(cè)定結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中M.tb抗原CFP-10的動(dòng)態(tài)變化，并同步運(yùn)用流式細(xì)胞法檢測(cè)了CFP-10刺激下細(xì)胞免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)改變，發(fā)現(xiàn)了CFP-10在抗結(jié)核治療過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的個(gè)體差異性，而這些抗原肽的動(dòng)態(tài)變化與外周IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例呈現(xiàn)正相關(guān)，與TNF-α+CD4+T細(xì)胞的比例無(wú)關(guān)聯(lián)性，提示我們目前所采用的IFN-γ釋放實(shí)驗(yàn)?zāi)撤N程度上可以反映患者外周結(jié)核分枝桿菌抗原的載量，而TNF-α+CD4+T細(xì)胞的水平則與抗原水平的關(guān)系一致性較差，上述基于結(jié)核病原學(xué)和機(jī)體免疫應(yīng)答水平的同步檢測(cè)，對(duì)于進(jìn)一步解析抗結(jié)核免疫應(yīng)答的病原學(xué)驅(qū)動(dòng)因素，建立新型抗結(jié)核治療療效評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物提供前期理論依據(jù)。后續(xù)將進(jìn)一步治療跟蹤樣本進(jìn)行擴(kuò)大研究。