何 力 蘭戴天 高青山 李 娟 鄧小林

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科,成都 610100)

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥，發(fā)病率和死亡率都很高[1]。三陰性乳腺癌 (triple-negative breast cancer，TNBC) 以雌激素受體 (ER)、黃體酮受體 (PR) 和人表皮生長(zhǎng)因子受體 (HER)-2缺乏表達(dá)為特征，占所有類型乳腺癌的15%[2]。TNBC具有早期轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的趨勢(shì)，是一項(xiàng)重大的臨床挑戰(zhàn)[3]。由于TNBC對(duì)內(nèi)分泌治療或其他現(xiàn)有靶向藥物沒有反應(yīng)，藥物治療的選擇僅限于傳統(tǒng)化療，而傳統(tǒng)化療往往陷入耐藥性問(wèn)題[4]。因此，有必要尋找對(duì)TNBC具有最小毒性且治療有效的新化合物。一種新型查爾酮化合物(millepachine，MIL)，該化合物首次從厚果崖豆藤中分離得到，具有2,2-二甲基苯并吡喃基序的苯并芘結(jié)構(gòu)，使其具有足夠的親脂性以確保良好的細(xì)胞膜滲透性[5]。MIL在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出對(duì)多種人類癌細(xì)胞的強(qiáng)大抗腫瘤作用，作為一種新型的抗癌藥物候選藥物，由于其結(jié)構(gòu)新穎、抗腫瘤活性強(qiáng)，對(duì)藥物研發(fā)具有潛在的重要意義[6]。因此，本研究選擇不同劑量的MIL處理MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，探索MIL對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的影響是否存在NF-κB通路的參與，以及該通路p65蛋白的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位情況，從而確定新的治療靶點(diǎn)，以期為MIL應(yīng)用于三陰性乳腺癌的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM/F12 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(Gibco 公司，美國(guó))；Cell Counting Kit-8(CCK-8)(同仁化學(xué)公司，日本)；ELX808酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司，美國(guó))；二喹啉甲酸 (Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒 (PIERCE公司，美國(guó))；MatrigelTM底膜基質(zhì) (BD公司，美國(guó))；p65,p-p65抗體(NEB公司，美國(guó))；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司，美國(guó))；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (Annexin PE/7-AAD) (南京凱基生物有限公司,中國(guó)) ；空氣恒溫?fù)u床(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速低溫離心機(jī)(Beckman公司，美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))；電泳槽，電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；FACS Vantage SE 流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP(UVP公司，美國(guó))；ChemiDoc XRS 凝膠/發(fā)光圖像分析儀(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株在補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所有細(xì)胞均在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率達(dá)到85%以上時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2給藥劑量與分組 MIL具有2,2-二甲基苯并吡喃基序的苯并芘結(jié)構(gòu)，使其擁有足夠的親脂性從而具有良好的細(xì)胞膜滲透性。將MDA-MB-231細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別在4組細(xì)胞的血清DMEM培養(yǎng)基中加入0、2、4、8 μmol/L的MIL繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將用不同濃度MIL處理的MDA-MB-231細(xì)胞分為：對(duì)照組(0 μmol/L MIL)；2 μmol/L MIL處理組；4 μmol/L MIL處理組；8 μmol/L MIL處理組。

1.2.3CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率 將MDA-MB-231細(xì)胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)24 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染后，經(jīng)不同濃度的MIL處理48 h后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書每孔加入10 μl CCK8試劑并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組吸光度，繪制折線圖并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)速度 (增殖倍數(shù)=細(xì)胞吸光度/0 h 細(xì)胞吸光度)。

1.2.4EDU染色 經(jīng)不同濃度的MIL處理過(guò)的各組細(xì)胞，用50 μmol/L的 EDU(EDU labeling/detection kit,Ribobio,Guangzhou,China)培養(yǎng)12 h，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min和5%的甘氨酸培養(yǎng)5 min,PBS 洗滌和0.5% Triton X-100破膜后，用抗EDU抗體孵育30 min,再用 5 μg/ml Hoechst 33342 染色30 min,熒光顯微鏡觀察并照相。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處理過(guò)的MDA-MB-231細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔的細(xì)胞量接種至6孔板中，置37℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。之后分別收集每個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞，按凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，用Annexin V-FITC和pro-pidium iodide (PI) (凱基生物公司，中國(guó)) 雙染法在FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀 (BD Biosciences,San Diego,CA) 上進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析使用FlowJo軟件 (TreeStar,Ashland,OR,USA)。

1.2.6Transwell 將MIL處理過(guò)的細(xì)胞消化離心，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)量種入上室，下室加入有血清的培養(yǎng)基。48 h后用無(wú)菌棉簽擦去小室上層細(xì)胞，將Transwell 小室，倒置風(fēng)干，并放入含有500 μl染色液(0.1%結(jié)晶紫)的12孔板中，染色 20 min，取出后在 PBS 中清洗3次，并風(fēng)干。在Transwell小室直徑上，取5個(gè)視野，在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。拍照后，在 24孔板中加入500 μl的33%醋酸，將Transwell小室置于其中，浸膜，振蕩10 min，充分溶解膜上染色物質(zhì)。將溶解液轉(zhuǎn)移到96孔板中，于酶標(biāo)儀上560 nm 測(cè)吸光度OD值，以此間接反應(yīng)侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7免疫印跡法 使用裂解緩沖液(Beyotime，Shanghai，China)裂解細(xì)胞樣品。然后，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Beyotime)定量蛋白質(zhì)濃度。含有20 mg蛋白質(zhì)的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗 (p65,1∶1 000;p-p65,1∶1 000)于4℃封閉過(guò)夜，第二天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL,設(shè)置曝光參數(shù)，檢測(cè)目的條帶對(duì)應(yīng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱。

1.2.8RT-PCR 使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過(guò)超微紫外光分光光度計(jì)在260和280 nm處測(cè)定吸光度。 按照試劑盒說(shuō)明書，使用Super RT cDNA試劑盒合成cDNA。 此外，使用Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit進(jìn)行PCR，分別在95℃ 15 s 和60℃ 60 s條件下使用ABI 7500將反應(yīng)激活。 用于該反應(yīng)的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin的引物信息如下：E-cadherin：5′-TGGGTTATTCCTCC-CATCAG-3′,5′-TTTGTCAGGGAGCTCAGGAT-3′； N-cadherin：5′-CACCCAACATGTTTACAATCAACAA-TTGAGAC-3′,5′-CTGCAGCAACAGTAAGGACAAACATCCTATT-3′； Vimentin：5′-GAAGAGAACTTTGCCGTTGAAG-3′，5′-ACGAAGGTGACGAGCCATT-3′； β-actin：5′-CAAAGACCTGTACGCCAACAC-3′。

1.2.9免疫熒光檢測(cè)p65的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位 將MDA-MB-231細(xì)胞接種到涂有纖連蛋白的玻璃蓋玻片上。培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗細(xì)胞，固定于預(yù)冷甲醇中，0.2% Triton X-100滲透。固定細(xì)胞在1.5%的正常山羊血清中預(yù)孵育，4℃下用一抗p65 (1∶100稀釋)孵育過(guò)夜。熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體37℃孵育后，將蓋玻片用PermaFluor Aqueous固定在載玻片上。使用Zeiss Axioplan Universal顯微鏡觀察熒光。

2 結(jié)果

2.1不同濃度的MIL對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，MDA-MB-231細(xì)胞的存活率都以MIL濃度依賴的方式降低，當(dāng)MIL濃度超過(guò)16 μmol/L時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05)。

2.2不同濃度的MIL對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 如圖2A所示，對(duì)照組可見大量EDU深色標(biāo)記的細(xì)胞。2、 4、8 μmol/L MIL三個(gè)處理組EDU深色標(biāo)記的細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少。如圖2B所示，與對(duì)照組比較，2、4、8 μmol/L MIL三個(gè)處理組EDU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。

圖1 CCK8檢測(cè)細(xì)胞的存活率

圖2 不同濃度MIL處理后MDA-MB-231細(xì)胞的增殖變化(EDU，×400)

圖3 不同濃度MIL處理后MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率變化

圖4 不同濃度的MIL處理后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的變化

2.3不同濃度的MIL對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 如圖3所示，對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率為(4.6%±0.5%)； 2、4、8 μmol/L MIL三個(gè)處理組細(xì)胞凋亡率分別為 (4.8%±0.8%)、(20%±2.3%)、(28.5%±2.9%)，較對(duì)照組明顯升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4不同濃度的MIL對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞侵襲力的抑制作用 如圖4A所示，與對(duì)照組比較，可觀察到4 μmol/L和8 μmol/L MIL兩個(gè)處理組侵入到小室膜底側(cè)的MDA-MB-231細(xì)胞數(shù)量明顯減少；如圖4B所示，與對(duì)照組比較，4 μmol/L和8 μmol/L MIL兩個(gè)處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。

圖5 不同濃度MIL處理后E-cadherin,N-cadherin,Vimentin mRNA的表達(dá)

圖6 不同濃度的MIL處理后p65磷酸化和p65核轉(zhuǎn)位的變化

2.5不同濃度的MIL對(duì)E-cadherin,N-cadherin,Vimentin表達(dá)的影響 如圖5所示，與對(duì)照組比較，2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L MIL處理組Vimentin mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；4 μmol/L 和8 μmol/L MIL兩個(gè)處理組E-cadherin mRNA的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；4 μmol/L和8 μmol/L MIL兩個(gè)處理組N-cadherin mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

2.6不同濃度的MIL對(duì)p65磷酸化和p65核轉(zhuǎn)位的影響 如圖6A所示，從Western blot條帶中可以看出，4 μmol/L和8 μmol/L MIL兩個(gè)處理組p-p65蛋白表達(dá)量對(duì)照組降低。Western blot灰度分析結(jié)果：與對(duì)照組比較，4 μmol/L和8 μmol/L MIL兩個(gè)處理組p65磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。如6B所示，免疫熒光染色法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組核轉(zhuǎn)位細(xì)胞的NF-κB p65熒光標(biāo)記主要濃集于核區(qū)，胞質(zhì)區(qū)減少，4 μmol/L和8 μmol/L MIL兩個(gè)處理組核轉(zhuǎn)位細(xì)胞的NF-κB p65熒光標(biāo)記主要濃集于胞質(zhì)區(qū)，核區(qū)減少，沒有明顯顯現(xiàn)。如圖6C所示,與對(duì)照組比較，4 μmol/L和8 μmol/L MIL兩個(gè)處理組核轉(zhuǎn)位細(xì)胞的NF-κB p65熒光標(biāo)記在核區(qū)顯著減少(P<0.05)。

3 討論

乳腺癌是世界上最常見的癌癥，也是女性癌癥死亡的主要原因[7]。盡管過(guò)去二十年來(lái)診斷和治療方式的進(jìn)步提高了乳腺癌患者的生存率，但由于TNBC具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性，且缺乏有效的治療方法，因此與其他亞型乳腺癌相比，TNBC復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險(xiǎn)仍然較高[8]。系統(tǒng)性常規(guī)化療是TNBC患者唯一的治療選擇，因?yàn)槿狈σ呀⒌陌悬c(diǎn)，如雌激素受體和HER2[9]。因此，迫切需要開發(fā)新的有效、安全的TNBC治療藥物。

MIL對(duì)人體癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠抑制癌細(xì)胞的增殖。MIL對(duì)多種類型的腫瘤具有增殖抑制作用，據(jù)報(bào)道MIL在卵巢癌細(xì)胞中具有抗腫瘤活性，呈劑量依賴性地抑制卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和A2780S的增殖[10]。在隨后的研究中也發(fā)現(xiàn)MIL顯著抑制對(duì)順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞A2780CP的增殖[11]。與前人研究結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)不同濃度MIL處理后，細(xì)胞增殖明顯降低，且MIL對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，MIL 對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，表明MIL能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)。

MIL在體內(nèi)和體外可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)MIL通過(guò)ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位呈劑量依賴性降低[6]。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)MIL以濃度依賴性方式誘導(dǎo)SK-OV-3和A2780S細(xì)胞凋亡。同樣地，MIL可誘導(dǎo)順鉑敏感的A2780S和耐順鉑的A2780CP細(xì)胞顯著凋亡[11]。與前人的研究結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)MIL能夠明顯提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞凋亡率，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與MIL在不同的癌癥中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所起作用的差異有關(guān)，其有待以后進(jìn)一步的研究。Wu等[6]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)MIL處理后凋亡的HepG2細(xì)胞百分比從40.0%上升到77.1%，SK-HEP-1細(xì)胞也呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性凋亡。 用AO/EB染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，觀察到明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，包括膜起泡和顆粒性凋亡小體；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可誘導(dǎo)MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞凋亡本研究發(fā)現(xiàn)MIL能夠明顯提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞凋亡率，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與MIL在不同的癌癥中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所起作用存在差異有關(guān)，其有待以后進(jìn)一步研究。

惡性腫瘤細(xì)胞具有向周圍正常組織浸潤(rùn)和侵襲的能力[12]。在有關(guān)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的研究中，Jeon等[13]研究發(fā)現(xiàn)IL-1 b增強(qiáng)TNBC細(xì)胞的侵襲能力，花姜酮處理后降低了MDA-MB231細(xì)胞和Hs578T細(xì)胞的侵襲率，即 TNBC細(xì)胞的侵襲能力下降。Hseu等[14]測(cè)量MDA-MB-231細(xì)胞侵襲數(shù)發(fā)現(xiàn)據(jù)報(bào)道，通過(guò)香杉芝治療后可顯著降低MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力；在怡萊霉素C治療條件下，MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞數(shù)量明顯減少，侵襲率降低，引起兩種TNBC細(xì)胞侵襲能力降低[15]。相似的，本研究發(fā)現(xiàn)MIL能夠明顯降低MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲數(shù)，表明MIL具有抑制TNBC細(xì)胞侵襲能力的作用。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mensenchymal transition，EMT)是一種與遷移和侵襲相關(guān)的重要機(jī)制，而 EMT 的發(fā)生通常伴隨著標(biāo)志物的變化，主要包括E-cadherin、N-cadherin和Vimentin。E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的恢復(fù)與乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移抑制有關(guān)。Hseu等[14]研究發(fā)現(xiàn)使用香杉芝治療后，劑量依賴性地提高了E-cadherin的mRNA表達(dá)，降低了N-cadherin的mRNA表達(dá)，用香杉芝處理MDA-MB-231細(xì)胞時(shí)，下調(diào)vimentin的表達(dá)，延緩了乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。MIL具有一定的抗腫瘤作用，其可通過(guò)降低Eg5蛋白的水平從而在抗腫瘤上起著一定作用[16]。在順鉑耐藥的人卵巢癌中，MIL的抗腫瘤作用與其ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)受到抑制有關(guān)[11]。類似的，本研究發(fā)現(xiàn)MIL能明顯降低N-cadherin和vimentin的mRNA表達(dá)，以及明顯提高E-cadherin mRNA的表達(dá)，表明MIL能夠抑制TNBC的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。

NF-κB與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及對(duì)腫瘤的耐藥性有關(guān)，NF-κB活化在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[17]。活化的NF-κB會(huì)增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并抑制促凋亡蛋白Bax，這與化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn)香杉芝處理的細(xì)胞中呈劑量依賴性抑制NF-κB活化，降低 NF-κB p65蛋白水平[14]。同樣，人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇可抑制NF-κB的活化并調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[19]。目前尚未有MIL對(duì)NF-κB活化的相關(guān)研究，本研究發(fā)現(xiàn)MIL明顯抑制p65磷酸化水平，減少核區(qū)核轉(zhuǎn)位細(xì)胞的NF-κB p65熒光標(biāo)記量，表明MIL能夠有效地抑制NF-κB p65的活化。

綜上所述，本研究選擇不同劑量的MIL處理MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MIL通過(guò)抑制NF-κB p65的活化有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲能力并促進(jìn)其發(fā)生凋亡，表明MIL對(duì)三陰性乳腺癌有緩解作用，為MIL應(yīng)用于三陰性乳腺癌的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。