馬 競(jìng) 武國利 許金鵬 常 亮 李 靖 (河北大學(xué)附屬醫(yī)院，保定 071000)

心肌梗死是中國乃至全世界心力衰竭與死亡的主要原因之一，有研究顯示其發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)[1,2]。健康飲食、生活方式的改變及藥物治療等有助于改善患者的臨床癥狀，冠狀動(dòng)脈旁路移植、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療等外科手術(shù)可以恢復(fù)血供并減少心肌損傷，但是現(xiàn)有的治療方法并不能從根本上修復(fù)受損的心肌并改善受損的心功能。干細(xì)胞具有自我復(fù)制能力，在一定的條件下可分化為3個(gè)胚層的各類細(xì)胞，為心肌梗死治療帶來了新的思路。

間充質(zhì)干細(xì)胞為治療心肌梗死的理想細(xì)胞，能夠通過旁分泌效應(yīng)來改善血管生成，減少缺血性誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，調(diào)控炎癥反應(yīng)并增加前體細(xì)胞的招募及分化[3,4]。胡繼宏等[5]研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可提高心肌梗死大鼠的心肌抗氧化能力，減少細(xì)胞凋亡和自噬，促進(jìn)鉀離子通道蛋白Kv1.5的表達(dá)。賀繼剛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GATA-4的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過增強(qiáng)“歸巢”效應(yīng)、促進(jìn)心肌梗死局部血管增生、有效動(dòng)員C-kit陽性細(xì)胞而修復(fù)心肌損傷。與目前廣泛研究的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有獲取簡單、來源廣泛、增殖能力強(qiáng)、受年齡因素影響小、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)。汪兆艷等[7]研究顯示自體與異體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞均可有效改善急性心肌梗死大鼠的心功能，并且自體移植的效果優(yōu)于異體移植。氧化苦參堿作為中藥苦參的有效成分之一具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)，發(fā)揮重要的抗腫瘤、抗纖維化、調(diào)控免疫與保護(hù)血管內(nèi)皮、保肝等功效，近年來在心血管領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注。相繼的大量研究證實(shí)，氧化苦參堿可改善急性心肌梗死及心力衰竭導(dǎo)致的心室重構(gòu)，改善缺血再灌注心肌損傷的心功能及細(xì)胞凋亡等，具有顯著的心肌保護(hù)作用。為進(jìn)一步提升間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死的效果，本實(shí)驗(yàn)選擇脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為移植細(xì)胞，探討氧化苦參堿對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死大鼠心肌修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器 氧化苦參堿(CAS號(hào):16837-52-8)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；Ⅰ型膠原蛋白酶(PP0008)購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自濟(jì)南海智科技發(fā)展有限公司；APC-CD90(BDLS0874)購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；PE-CD44(9400-09)、PE-CD34(9597-16)、PE-CD45抗體(1660-09)購自艾美捷科技有限公司；血清肌鈣蛋白檢測(cè)試劑盒(MB-6914B)購自濰坊祺翔生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(KL-LDH-Ra)購自上?？道噬锟萍加邢薰荆荒X鈉肽前體(NT-proBNP)購自杭州普望生物技術(shù)有限公司；VINNO小型動(dòng)物專用彩色超聲影像系統(tǒng)購自北京益仁恒業(yè)科技有限公司，CytoFLEX流式細(xì)胞儀(CytExpert)分析軟件。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(220.15±19.36)g，購自河北北方學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2012-004 。飼養(yǎng)環(huán)境：18～26℃，相對(duì)濕度：40%～70%，12 h明暗交替。

1.2方法

1.2.1脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 脫頸處死6只SD大鼠，備皮后在腹部做一“十”字切口，皮下游離至腹股溝，獲取脂肪組織約2 g，以含雙抗的PBS清洗3次；將剪碎的脂肪組織分裝入50 ml離心管內(nèi)，按照1∶2 的比例加入0.075%的Ⅰ型膠原蛋白酶，37℃條件下80 r/min水浴振蕩60 min；按照膠原酶的量加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，1 500 r/min離心11 min后去上清，將5 ml紅細(xì)胞裂解液加入細(xì)胞沉淀中裂解5 min。以PBS清洗，經(jīng)過細(xì)胞篩過濾后轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)，1 500 r/min 離心5 min后去上清，以含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置入37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基，此后每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)到80%～85%時(shí)，按照1∶2的比例傳代。取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

取第3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)細(xì)胞，以106個(gè)/管重懸于100 μl PBS中，分別在流式管上標(biāo)記APC-CD90、PE-CD44、PE-CD34、PE-CD45，設(shè)置相應(yīng)抗體的同型IgG為陰性對(duì)照，向流式管內(nèi)加入對(duì)應(yīng)的抗體后，上流式細(xì)胞儀分析。

1.2.2急性心肌梗死造模方法 麻醉SD大鼠后，仰臥位固定于小型動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，描記Ⅱ?qū)?lián)心電圖；常規(guī)備皮、消毒后暴露皮下組織，在左側(cè)第4、5肋間隙進(jìn)入胸腔，剪開心包膜，暴露心臟后穿線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，觀察心臟收縮功能減弱、左心室前壁由紅色變白且心電圖ST段弓背明顯抬高，提示造模成功。術(shù)后肌注青霉素預(yù)防感染。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 將80只SD大鼠隨機(jī)分4組，每組20只。 假手術(shù)組只將線穿過左冠狀動(dòng)脈前降支但不結(jié)扎；心肌梗死組、干細(xì)胞組、干細(xì)胞+中藥組建立急性心肌梗死模型，造模成功后30 min，干細(xì)胞組、干細(xì)胞+中藥組在心肌梗死邊緣隨機(jī)選3點(diǎn)注射2 ml脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液(約含細(xì)胞4×106)，術(shù)后干細(xì)胞+中藥組灌胃給予氧化苦參堿25 mg/(kg·d)[8]，心肌梗死組、干細(xì)胞組灌胃給予等效劑量的生理鹽水，灌胃治療2周。

1.2.4檢測(cè)指標(biāo) 心功能檢測(cè)：治療2周后以水合氯醛麻醉大鼠，備皮后右側(cè)臥位固定在小型動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，利用小型動(dòng)物專用彩色超聲影像系統(tǒng)檢測(cè)左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。4個(gè)參數(shù)測(cè)定值均取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期平均值。

血清心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)：治療2周后，于各組大鼠尾靜脈采血，離心取上清液，按照試劑盒說明，利用ELISA 法測(cè)血清肌鈣蛋白(cardiac troponin T/I,cTnT-I)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、腦鈉肽前體(pro-brain natriuretic peptide,Pro-BNP)水平。簡要步驟如下：在500 μl樣本稀釋液中加入5 μl血清樣本混勻，在各反應(yīng)孔中加入稀釋的10 μl血清樣本，然后將100 μl酶試劑加入各反應(yīng)孔中，25℃放置45 min，水洗、吸干后加入100 μl顯色劑，室溫孵育20 min，加入終止液，在450 nm處利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，計(jì)算樣本濃度。

心肌梗死面積檢測(cè)：待大鼠完成心功能檢測(cè)后，每組隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后取出心臟，以PBS清洗干凈，在心尖部穿棉繩，將心臟懸掛于-20℃冷凍20 min；取出心臟后在錫箔紙上橫切為3 mm的薄片，加入TTC染色液37℃恒溫染色60 min，每10 min 翻動(dòng)1次；置于中性甲醛溶液中固定24 h，利用Image Pro plus 60軟件分析心肌梗死面積。心肌梗死面積(%)=梗死面積/左心室總面積×100%。

心肌病理組織學(xué)觀察：每組取剩余的10只大鼠，麻醉后取出心臟，獲取左心室心肌組織，置入多聚甲醛中固定4 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、制作5 μm石蠟切片。脫蠟后水化，蒸餾水沖洗，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，隨后依次進(jìn)行乙醇脫水→二甲苯透明→中性樹脂封固→顯微鏡下觀察組織損傷情況。

2 結(jié)果

2.1脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 接種36 h可見細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)為多角形或梭形；培養(yǎng)到第7天時(shí)，約80%細(xì)胞到達(dá)融合，細(xì)胞生長及形態(tài)良好；第3代細(xì)胞呈成纖維樣生長，表面標(biāo)記物CD90、CD44呈陽性表達(dá)，CD34、CD45呈陰性表達(dá)，見圖1。

2.2造模后動(dòng)物一般情況 在造模過程中，60只大鼠因室顫、心力衰竭與氣胸死亡4只，造模成功率為90%，為了保證實(shí)驗(yàn)中造模動(dòng)物數(shù)量，參照實(shí)驗(yàn)造模方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物補(bǔ)齊。造模后第1天，大鼠精神萎靡，于術(shù)后第3天恢復(fù)，術(shù)后7 d恢復(fù)正常進(jìn)食量與活動(dòng)量。

2.3心功能檢測(cè) 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組左心室收縮末期內(nèi)徑與左心室舒張末期內(nèi)徑明顯增加，左心室短軸縮短率與左室射血分?jǐn)?shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與心肌梗死組比較，干細(xì)胞組、干細(xì)胞+中藥組左心室收縮末期內(nèi)徑與左心室舒張末期內(nèi)徑明顯減少，左心室短軸縮短率與左室射血分?jǐn)?shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+中藥組左心室收縮末期內(nèi)徑與左心室舒張末期內(nèi)徑明顯減少，左心室短軸縮短率與左室射血分?jǐn)?shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.4血清心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組乳酸脫氫酶活性明顯升高，肌鈣蛋白、腦鈉肽前體濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與心肌梗死組比較，干細(xì)胞組、干細(xì)胞+中藥組乳酸脫氫酶活性明顯降低，肌鈣蛋白、腦鈉肽前體濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+中藥組乳酸脫氫酶活性明顯降低，肌鈣蛋白、腦鈉肽前體濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

圖1 第3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)與表面標(biāo)記物檢測(cè)

GroupsLVEDD(mm)LVESD(mm)LVEF(%)FS(%)Sham5.74±0.213.49±0.3490.21±1.9959.13±1.09AMI7.19±0.171)5.89±0.371)40.29±1.781)20.30±1.481)AMI+Cell6.73±0.161)2)5.25±0.151)2)62.37±2.141)2)28.62±3.121)2)AMI+Cell+Drug6.09±0.331)2)3)4.37±0.281)2)3)81.69±2.671)2)3)46.37±3.261)2)3)F9.888.27121.7195.62P<0.05<0.05<0.01<0.01

Note:Compared with Sham group,1)P<0.05;compared with AMI group,2)P<0.05;compared with AMI+Cell group,3)P<0.05.

GroupsLDH(U/L)cTnT-I(μg/L)Pro-BNP(ng/L)Sham319.64±7.661.30±0.2188.41±3.22AMI2 037.21±120131)18.64±4.281) 649.78±15.311)AMI+Cell 1 496.77±78.251)2) 9.62±3.571)2) 398.27±20.111)2)AMI+Cell+Drug 506.32±31.141)2)3) 4.18±1.991)2)3) 163.18±19.741)2)3)F753.26201.10582.48P<0.01<0.05<0.01

Note:Compared with Sham group,1)P<0.05;compared with AMI group,2)P<0.05;compared with AMI+Cell group,3)P<0.05.

圖2 各組大鼠心肌組織橫截面TTC 染色

圖3 各組大鼠心肌組織病理組織學(xué)觀察(HE,×200)

2.5心肌梗死面積檢測(cè) 假手術(shù)組大鼠心臟組織光滑且紅潤；心肌梗死組大鼠心臟組織表面可見明顯的蒼白區(qū)域；干細(xì)胞組、干細(xì)胞+中藥組大鼠心臟組織蒼白區(qū)域明顯少于心肌梗死組，并且以干細(xì)胞+中藥組減少更明顯，見圖2；心肌梗死組、干細(xì)胞組、干細(xì)胞+中藥組大鼠心肌梗死面積分別為(42.39±1.35)%、(28.08±3.16)%、(14.79±2.27)%，3組間心肌梗死面積比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6心肌病理組織學(xué)觀察 蘇木精-伊紅染色后鏡下觀察顯示，假手術(shù)組大鼠心肌肌原纖維結(jié)構(gòu)及排列規(guī)則，未見充血與細(xì)胞間質(zhì)水腫，無炎性細(xì)胞浸潤；心肌梗死組大鼠心肌肌原纖維排列混亂不規(guī)則，可見帶狀空泡狀病變，細(xì)胞核固縮，肌原纖維間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，包括紅細(xì)胞與中性粒細(xì)胞；干細(xì)胞組大鼠心肌肌原纖維結(jié)構(gòu)及排列較心肌梗死組明顯改善，心肌組織出血壞死明顯減輕，肌原纖維間質(zhì)內(nèi)仍可見炎性細(xì)胞浸潤；干細(xì)胞+中藥組大鼠心肌肌原纖維結(jié)構(gòu)完整且排列規(guī)則，肌原纖維間質(zhì)內(nèi)僅見輕度水腫，心肌損傷程度低于干細(xì)胞組，見圖3。

3 討論

氧化苦參堿又名苦參素，為提煉于苦參或平科植物廣豆根中的生物堿，具有抗病毒、抗炎、降壓等作用。體外研究顯示，氧化苦參堿具有抗過氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激損傷[9]。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，苦參提取物可通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路減輕缺血再灌注大鼠的心肌氧化損傷；氧化苦參堿能增加急性心肌梗死后心輸出量，改善急性心肌梗死家兔左心室重構(gòu)參數(shù)，改善心功能指標(biāo)[10,11]。因此，實(shí)驗(yàn)將氧化苦參堿應(yīng)用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死的過程中，觀察其是否可進(jìn)一步提升脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果。

心功能與左心室重構(gòu)參數(shù)的改變是評(píng)價(jià)急性心肌梗死治療效果好壞的關(guān)鍵指標(biāo)[12,13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌梗死后大鼠的心功能發(fā)生了明顯改變：左心室收縮末期內(nèi)徑與左心室舒張末期內(nèi)徑明顯增加，左心室短軸縮短率與左室射血分?jǐn)?shù)明顯減少，表明大鼠左心室收縮與舒張功能明顯受損；而單純的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合氧化苦參堿治療均明顯改善心肌梗死大鼠的心功能，同時(shí)聯(lián)合治療組的改善作用更明顯。遺憾的是本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行左心室重構(gòu)參數(shù)的觀察，其相關(guān)結(jié)果有待進(jìn)一步的研究。

臨床實(shí)踐證明，血清心肌酶水平可反映心肌細(xì)胞的損傷程度，包括乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌鈣蛋白、腦鈉肽前體等，其中以肌鈣蛋白表達(dá)水平的敏感性和特異性最高，為目前較理想的心肌梗死標(biāo)志物[14-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心肌梗死造模后，大鼠血清乳酸脫氫酶、肌鈣蛋白、腦鈉肽前體水平明顯升高，提示心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損，導(dǎo)致心肌細(xì)胞中多種活性酶大量漏出而進(jìn)入血液中；脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植或脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合氧化苦參堿治療可修復(fù)受損的心肌細(xì)胞，減少血清中乳酸脫氫酶、肌鈣蛋白、腦鈉肽前體水平，其中聯(lián)合治療的作用更明顯。同時(shí)實(shí)驗(yàn)顯示，干細(xì)胞組與干細(xì)胞+藥物組的心肌梗死面積明顯少于心肌梗死組，同時(shí)病理觀察顯示干細(xì)胞組與干細(xì)胞+藥物組的心肌損傷程度明顯低于心肌梗死組，并且干細(xì)胞+藥物組的心肌損傷程度輕于干細(xì)胞組，說明與單獨(dú)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植比較，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合氧化苦參堿可進(jìn)一步修復(fù)受損的心肌。

目前的研究認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死的作用包括免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗纖維化、抗心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成及促進(jìn)心肌再生。預(yù)實(shí)驗(yàn)在過氧化氫誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿干預(yù)可抑制模型中脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡，并提高其活性。因此我們認(rèn)為心肌梗死時(shí)導(dǎo)致心肌局部微環(huán)境改變，氧化苦參堿干預(yù)后能刺激移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并提高其活性，使相對(duì)更多的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至受損心肌處進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)心肌與毛細(xì)血管的增生，達(dá)到減少心肌梗死面積、改善心肌功能的目的。同時(shí)氧化苦參堿自身具有抗炎作用，其干預(yù)可進(jìn)一步改善移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所處的局部微環(huán)境，提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下的抗氧化酶活性，降低炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的釋放與分泌，從而提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，我們認(rèn)為氧化苦參堿與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有協(xié)同抗炎作用。PI3K/Akt信號(hào)通路為介導(dǎo)膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，可調(diào)控細(xì)胞的增殖、代謝、凋亡等重要生理功能，其在新血管疾病的發(fā)生與發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。Akt通過激活下游分子Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-9等促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。因此，推測(cè)氧化苦參堿可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路、提高p-Akt水平來促進(jìn)移植的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞存活與增殖的，將在下一步的實(shí)驗(yàn)中對(duì)此推測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死大鼠中應(yīng)用氧化苦參堿的效果顯著，可改善大鼠心功能、減輕心肌損傷、促進(jìn)心肌修復(fù)。但是本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較短，并且未設(shè)置單純氧化苦參堿干預(yù)組，所以脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合氧化苦參堿治療心肌梗死的效果有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。