李俊磊，張紅兵

(河北經(jīng)貿大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050061)

隨著經(jīng)濟發(fā)展和人口增長，人們對能源的依賴日趨加劇，但石油、天然氣等石化能源燃燒會產(chǎn)生大量的CO2，加速溫室效應，產(chǎn)生的NO2、SO2和PM 2.5會造成大氣污染，成為亟待解決的問題。以生物油脂為原料生產(chǎn)的生物柴油(脂肪酸甲酯)含硫低、潤滑好、易燃燒，有替代傳統(tǒng)柴油的潛力，成為近年來生物能源研發(fā)的熱點。與傳統(tǒng)能源作物大豆、玉米、油菜、麻風樹等相比，微藻生長速率快、適應性強、不占用耕地，可與廢氣廢水治理相結合，是理想的生物能源制備原料。

微藻的油脂含量是影響終產(chǎn)品成本的關鍵因素之一，目前微藻型生物柴油的價格較高，難以推動其商業(yè)化應用。隨著人們對微藻脂質合成與代謝途徑研究的不斷深入，從現(xiàn)有微藻出發(fā)，利用基因工程方法對相關基因進行改造，增加微藻脂質積累水平，相比傳統(tǒng)的微藻培養(yǎng)優(yōu)化無疑是一條捷徑。本文從微藻脂質的合成途徑出發(fā)，綜述了國內外利用基因工程技術改造微藻，提高脂質積累的方法，并對應用前景進行了展望。

1 TAG的合成途徑

TAG是微藻中組成中性脂質的主要成分，在藻細胞處于靜止生長期或壓力條件下容易積累。TAG在酸、堿或酶等存在的條件下，可以與甲醇進行酯交換生成生物柴油和甘油。微藻內TAG的合成可分為葉綠體內脂肪酸合成途徑、游離脂肪酸跨膜、內質網(wǎng)上的Kennedy途徑和包裝油脂小滴四個階段。其中脂肪酸合成途徑和Kennedy途徑是TAG合成的關鍵，調控這兩個途徑是提高微藻脂質積累的突破口。

1.1 脂肪酸合成途徑

1.2 Kennedy途徑

脂酰輔酶A(acyl-CoA)和3-磷酸甘油(G3P)是Kennedy途徑的直接前體，acyl-CoA由穿過葉綠體膜的FFA經(jīng)脂肪酸硫激酶催化形成，G3P由磷酸二羥基丙酮(DHAP)經(jīng)3-磷酸甘油脫氫酶(G3PDH)催化產(chǎn)生。甘油三磷酸?；D移酶(GPAT)催化acyl-CoA的脂?；D移到G3P的sn-1位，酯化生成溶血磷脂酸(LPA)。溶血磷脂酸?；D移酶(LPAAT)繼續(xù)催化LPA的sn-2位酯化生成磷脂酸(PA)。PA在磷脂酸磷酸酶(PAP)的作用下脫去磷酸形成二酰甘油(DAG)。最后DAG在二酰甘油?；D移酶(DGAT)作用下sn-3位酯化形成TAG。

2 基因工程方法增加微藻脂質積累

生物信息學研究發(fā)現(xiàn)微藻與植物的脂質合成過程高度相似，可借鑒現(xiàn)有高等植物對TAG合成的研究結果，利用基因工程方法從增強脂肪酸合成、增強Kennedy途徑和抑制脂肪的合成競爭三類途徑提高微藻脂質的積累。

2.1 增強脂肪酸合成途徑

脂肪酸合成途徑中的關鍵酶主要包括PDH、ACCase、FAS、碳酸酐酶(CA)。

PDH的活性與TAG的積累具有很強的相關性，并受丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)負調控，Ma等[1]通過RNA干擾敲低了微藻內的PDK基因(NsPDK)，使碳通量轉向TAG積累，且改造后的基因工程藻細胞不受高光抑制。

ACCase抑制劑的存在會導致TAG累積水平顯著下降，但研究發(fā)現(xiàn)過表達ACCase卻不能提高微藻脂質積累，推測可能是受到了反饋抑制，其后續(xù)的研究不多[2-3]。

FAS催化脂肪酸碳鏈的加長，但目前尚未見到成功高表達FAS的報道。

2.2 增強Kennedy途徑

相對于脂肪酸合成途徑，Kennedy途徑相對更靠近目標產(chǎn)物，因此更容易影響TAG的合成。與Kennedy途徑相關的限速酶主要包括：GPAT、LPAAT、PAP、DGAT、G3PDH。

Niu等[6]在三角褐指藻中過表達GPAT基因，經(jīng)尼羅紅熒光染色發(fā)現(xiàn)其中性脂質含量增加了2倍，GC-MS分析顯示不飽和脂肪酸比例與野生型相比顯著提高，更有利于生產(chǎn)生物柴油。Balamurugan等[7]發(fā)現(xiàn)AGPAT1的過表達會促進富油新綠藻中參與TAG合成的其他關鍵基因如DGAT2和GPAT的表達，使TAG含量增加1.81倍，同時多不飽和脂肪酸中的EPA和DHA顯著增加，而總碳水化合物和可溶性蛋白質含量低。

LPAAT是Kennedy途徑的第二個?；D移酶，Chungjatupornchai等[8]將萊茵衣藻的NeoLPAAT1穩(wěn)定過表達至原始藻株的2倍，使TAG含量增加2.1～2.2倍，產(chǎn)率增加1.9～2.8倍。Wang等提出了一種結合遺傳操作與間歇性熱休克結合的新策略，將其它藻源的c-LPAAT和c-GPD1插入到萊茵衣藻的DNA中，3次熱休克后c-LPAAT和c-GPD1的轉錄水平增加了5.3和8.6倍，脂質含量分別增加44.5%和67.5%。

PAP催化PA的去磷酸化，形成DAG和無機正磷酸鹽，該反應在TAG的合成中是不可或缺的。Deng等[9]發(fā)現(xiàn)三角褐指藻中CrPAP2的mRNA水平比無氮培養(yǎng)條件時高，使用RNA干擾方法沉默CrPAP2基因后可導致脂質含量下降2.4%～17.4%，而過表達CrPAP2基因則導致脂質含量增加7.5%～21.8%，證明CRPAP2具有影響脂質合成的潛力。

DGAT是催化TAG生物合成最后步驟的關鍵酶。為了增加TAG含量，Klaitong等[10]在富油新綠藻中過表達NeoDGAT2，使其轉錄水平提高2倍，發(fā)現(xiàn)脂質積累加速，轉化后TAG含量增加1.8～3.2倍，產(chǎn)率提高1.6～4.3倍。Niu[11]在三角褐指藻中過表達DGAT2后中性脂質含量增加了35%，多不飽和脂肪酸比例顯著增加，且生長速率保持在較高水平，與Li等[12]的報告相似。

除了過表達單個或數(shù)個靶基因，Zou等[13]嘗試在三角褐指藻中引入高效的組成型啟動子Pt211來增加多個靶基因的表達水平。QPCR分析表明參與TAG生物合成的GUS、GPAT和DGAT2等基因在Pt211驅動下顯示更高的轉錄豐度，并且不影響藻類的生長和光合作用。

2.3 抑制脂肪合成的競爭途徑

淀粉合成途徑會與Kennedy途徑競爭共同前體G3P，抑制脂肪合成的競爭途徑，改變碳分配方向，也能夠提高微藻脂質積累水平。研究表明，萊茵衣藻的CONSTANS基因具有調節(jié)淀粉含量的作用，Deng等[14]敲低CONSTANS基因的表達，發(fā)現(xiàn)TAG生物合成相關基因(DGAT2、PAP2和PDAT3)的表達水平提高，使TAG含量增加24.5%。

微綠球藻是一種高產(chǎn)油的藻種，Ajjawi等[15]用RNA-seq分析在氮剝奪期間作為脂質合成負調節(jié)劑的多種轉錄因子，利用CRISPR-Cas9敲除真菌 Zn(II)2Cys6 編碼基因的同源物，發(fā)現(xiàn)能夠改善微藻在營養(yǎng)充足條件下總碳與脂質的分配，雖然突變體生長不良，但產(chǎn)生的脂質卻是野生型的2倍。

3 總結與展望

微藻在非脅迫條件下進行碳捕獲，合成和儲存淀粉以支持生長和細胞分裂，只有在脅迫條件下傾向于以生長為代價積累大量的儲存脂質，因此有必要對微藻TAG的生物合成途徑和代謝調控進行深入的研究，在保持高生長速度的同時增加脂質積累，這對于生物柴油的生產(chǎn)是至關重要的。已有的研究成果表明，增強脂肪酸合成途徑、增強Kennedy途徑和抑制脂肪合成的競爭途徑都能夠影響TAG的合成。

與此同時，也要考慮基因工程微藻對生態(tài)系統(tǒng)的潛在風險，在將新型突變菌株作為工業(yè)用途之前，必需通過環(huán)境風險評估，防止具有優(yōu)勢的轉基因微藻如果借助開放的水域中逃逸到外部環(huán)境，打破原有的生態(tài)平衡。

雖然基因工程手段增加微藻油脂積累的相關研究才剛剛起步，但鑒于其針對性強、效率高、潛在的經(jīng)濟效益突出，其科學意義和應用價值明顯，成為越來越多的研究人員的關注焦點和研究熱點，隨著新發(fā)現(xiàn)和新成果的不斷涌出，微藻產(chǎn)油的商業(yè)化應用必定會實現(xiàn)。