劉 波，劉 穎，王 滌，邢學(xué)良

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-ischemicbraindamage,HIBD）是指新生兒在圍產(chǎn)期或出生后因缺氧缺血而引起中樞神經(jīng)受損的腦部疾病。近年來，已有證據(jù)證實細(xì)胞凋亡在缺氧缺血性腦損傷過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。針康法是將頭穴叢刺與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)結(jié)合起來的治療方法，其對缺氧缺血性腦損傷患兒的運動、感覺、認(rèn)知功能的提高及神經(jīng)損傷的修復(fù)都發(fā)揮了重要作用[3]。動物實驗表明，針康法可以通過調(diào)節(jié)控細(xì)胞凋亡相關(guān)因子及細(xì)胞凋亡通路等方式來降低缺血缺氧發(fā)生后腦神經(jīng)的損傷程度，發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用[4]。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）及死亡基因受體（Fas）作為細(xì)胞凋亡相關(guān)因子，在缺氧缺血損傷發(fā)生后發(fā)揮促凋亡作用，阻礙神經(jīng)元的修復(fù)與再生[5]。本實驗就缺氧缺血性腦損傷新生大鼠大腦皮質(zhì)中的AIFmRNA、FasmRNA 及細(xì)胞凋亡情況進行研究，同時運用針康法對大鼠進行治療，探討針康法治療缺氧缺血性腦損傷的作用機制。

1 實驗材料

出生7 日齡Wistar 大鼠幼仔160 只，由遼寧長生生物科技有限公司提供，許可證編號：SYXK（遼）2010-0001，雌雄不限，體質(zhì)量均在11～15 g。8%O2+92%N2混合氣體（哈爾濱鼎新工業(yè)氣體有限公司）；針灸針（0.25 mm×25 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；轉(zhuǎn)棒疲勞儀（上海欣軟）；超速冷凍離心機（湖南湘儀）；PCR 儀（杭州BIOER）；電泳儀（北京六一）；真空干燥箱（上海SYSBERTY）；凝膠成像分析儀（北京六一）；CX41 型生物顯微鏡（日本OLYMPUS）。Tunel 凋亡試劑盒（武漢博士德公司）；總RNA 提取試劑盒（Trizol 法）；AIF、Fas 及GAPDH 引物合成（上海生工生物工程有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen）。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 建立HIBD 的Rice-Vannucci 模型和假手術(shù)模型[6]。將出生7 日齡Wistar 大鼠幼仔采用無水乙醚吸入麻醉方式進行麻醉（1.0～2.0 min），仰臥位固定，充分暴露頸部。局部碘伏消毒后，沿頸正中線剪開皮膚及皮下組織，分離出左側(cè)頸總動脈，用0 號絲線行左側(cè)頸總動脈雙結(jié)扎后縫合頸部皮膚。術(shù)后將大鼠幼仔置于帶有母鼠氣味的窩中恢復(fù)2 h，然后再將大鼠幼仔放入37 ℃的有機玻璃缺氧箱中，持續(xù)充以氣流量為1 L/min 的8%氧氣，92%氮氣混合氣體2 h。建模后，將出現(xiàn)夾尾左旋的大鼠幼仔納入實驗。假手術(shù)組則只需要剪開大鼠頸部的皮膚并分離出左側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，縫合皮膚后也不予缺氧處理，結(jié)束后放回母鼠籠中喂養(yǎng)。

2.2 分組及干預(yù)方法 將7 日齡Wistar 大鼠幼仔隨機分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組與針康組5組，每組按建模后觀察時間點的不同又分為12、24、48、72 h 這4 個亞組，每個亞組8 只大鼠幼仔。假手術(shù)組手術(shù)后回籠飼養(yǎng)，予以同等條件下的抓取。模型組造模后回籠飼養(yǎng)，予以同等條件下的抓取。針刺組造模后采用頭穴叢刺針法對大鼠幼仔進行治療。采用1.0寸針灸針，取百會穴及百會穴左、右側(cè)各旁開1 mm處進行針刺，快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針2 h，每日針刺1次?？祻?fù)組予大鼠幼仔以轉(zhuǎn)籠、轉(zhuǎn)棒等綜合康復(fù)訓(xùn)練療法。轉(zhuǎn)籠為長100 cm，直徑為60 cm 的金屬圓柱形網(wǎng)籠，網(wǎng)籠分為4 格，可同時訓(xùn)練4 只大鼠幼仔。在進行轉(zhuǎn)籠訓(xùn)練時可將轉(zhuǎn)籠水平放置于金屬架上，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)籠一端的轉(zhuǎn)動柄，按需要轉(zhuǎn)動縱軸，每天訓(xùn)練10 min。轉(zhuǎn)棒為一根長75 cm，直徑為4.5 cm 的木棒，進行轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練時，將轉(zhuǎn)棒兩端懸掛，手動以5 r/min 的速度順、逆時針交替轉(zhuǎn)動木棒，每天訓(xùn)練10 min。針康組在造模后采用針康法進行治療。在大鼠幼仔頭穴叢刺針留針期間進行康復(fù)訓(xùn)練，1 次/d（針刺方案同針刺組，康復(fù)訓(xùn)練方案同康復(fù)組）。

2.3 采用RT-PCR 法檢測大腦皮質(zhì)中AIFmRNA 及FasmRNA 的表達水平 各組大鼠在治療結(jié)束后按規(guī)定時間點斷頭取腦，之后將左側(cè)大腦皮質(zhì)快速剝離。取材結(jié)束后按照總RNA 試劑盒說明書，運用Trizol法提取總mRNA，并進行電泳以檢測RNA 的完整性，之后在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)這一環(huán)節(jié)合成對應(yīng)的cDNA，其操作方法也參照試劑盒說明書進行，最后，當(dāng)聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)束時配制瓊脂糖凝膠進行電泳，運用凝膠成像系統(tǒng)對得到的凝膠進行拍照并分析數(shù)據(jù)。各引物序列見表1。

表1 AIF、Fas、GAPDH 引物序列

2.4 原位末端標(biāo)記法（TUNEL 法）檢測大腦皮質(zhì)中細(xì)胞凋亡變化 在規(guī)定時間點，大鼠乙醚麻醉后開胸，暴露心臟，剪開右心耳后將提前準(zhǔn)備好的帶有20 mL生理鹽水的注射器插入至左心尖以沖洗血流，隨后灌入20 mL 的4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PA）溶液，待灌注結(jié)束，迅速斷頭取腦剝離大腦皮質(zhì)并置于4%PA溶液中充分固定。48 h 后行脫水、浸蠟、石蠟包埋，將樣本制成5 μm 切片，之后進行TUNEL 染色，具體操作參照說明書。凋亡細(xì)胞，即陽性細(xì)胞在光鏡下呈棕黃色或棕褐色，非凋亡細(xì)胞，即陰性細(xì)胞呈藍色。在高倍鏡（10×40）下每只大鼠隨機選取5 張皮質(zhì)切片以觀察細(xì)胞凋亡的數(shù)量，后取均值作為統(tǒng)計參數(shù)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 19.0 軟件進行分析，各數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式表示，多組間比較選用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用TukeyHSD 法，計量資料分析應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 不同時間點各組新生大鼠腦皮質(zhì)中AIFmRNA與FasmRNA 的表達變化 見表2、表3。隨著缺氧缺血損傷時間的延長，假手術(shù)組在各時間點的AIF、FasmRNA 表達均不明顯，其余各組的AIF、FasmRNA在12 h 開始逐漸上升，并在24 h 時達到高峰，之后在48 h 和72 h 逐漸下降。與假手術(shù)組相比較，其余各組的AIF、FasmRNA 在各時間x 點的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組、康復(fù)組與針康組在各時間點的AIF、FasmRNA 表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；針康組與針刺組、康復(fù)組比較，其在各時間點的表達,差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 不同時間點各組AIFmRNA 與GAPDHmRNA 的比值比較（，n=8）

表2 不同時間點各組AIFmRNA 與GAPDHmRNA 的比值比較（，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與針刺組比較，▲P ＜0.05；與康復(fù)組比較，□P ＜0.05

3.2 不同時間點各組新生大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡情況 因大腦皮質(zhì)為細(xì)胞凋亡的易發(fā)區(qū)且對缺氧缺血損傷較為敏感，故本實驗選取皮質(zhì)進行細(xì)胞凋亡檢測。如表4 所示，除假手術(shù)組，其余各組的細(xì)胞凋亡數(shù)均在12 h 逐漸上升，并在24 h 時到達高峰，之后在各時間點逐漸下降。與假手術(shù)組相比，其余各組在各時間點內(nèi)的細(xì)胞凋亡數(shù)均具有顯著差異（P＜0.05）；后3組在各時間點與模型組相比，其細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；針康組的細(xì)胞凋亡數(shù)與針刺組及康復(fù)組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 不同時間點各組FasmRNA 與GAPDHmRNA 的比值比較（，n=8）

表3 不同時間點各組FasmRNA 與GAPDHmRNA 的比值比較（，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與針刺組比較，▲P ＜0.05；與康復(fù)組比較，□P ＜0.05

表4 不同時間點各組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)的比較（個/400 倍）（，n=8）

表4 不同時間點各組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)的比較（個/400 倍）（，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與針刺組比較，▲P ＜0.05；與康復(fù)組比較，□P ＜0.05

3 討論

針康法是傳統(tǒng)針灸技術(shù)與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)的結(jié)合，具有同步性、動態(tài)性、整體性等特點。針康法治療內(nèi)容的核心是，通過針刺刺激大腦皮層不同的反射區(qū)，加快大腦微循環(huán)的建立，并結(jié)合相應(yīng)的運動功能訓(xùn)練、感覺功能訓(xùn)練等現(xiàn)代康復(fù)治療方法，二者共同發(fā)揮效用，以非侵入的形式刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而達到促進大腦受損區(qū)域神經(jīng)組織修復(fù)的目的[7]。并有研究表明，針康法可以通過促進神經(jīng)軸突的重塑、維持細(xì)胞的存活、減少細(xì)胞凋亡、調(diào)控神經(jīng)營養(yǎng)因子的濃度，降低腦損傷后出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，進而促進缺氧缺血腦組織神經(jīng)功能的修復(fù)與再生[8]。

本次實驗結(jié)果顯示，針康法可以通過調(diào)節(jié)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)AIF 與Fas 的表達來發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用。AIF 是一種線粒體黃素蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和維持線粒體功能的作用[9-10]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，AIF 通過非Caspase 依賴性凋亡方式從線粒體中釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核中AIF 促進DNA 降解成20 至50-kb 并因此誘導(dǎo)細(xì)胞解體所需的染色質(zhì)凝聚[11-12]。YANG C X 等[13]研究證實，AIF表達下調(diào)時可以增加腦缺氧缺血損傷后新生兒腦內(nèi)細(xì)胞的存活率，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。并且關(guān)于本實驗中AIFmRNA 在各時間點的表達趨勢和AIFmRNA 在各時間點的動態(tài)變化與缺氧缺血性腦損傷后腦內(nèi)細(xì)胞凋亡變化規(guī)律吻合這兩個發(fā)現(xiàn)，都與徐艷等[14]研究參附注射液對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠AIF 表達變化的結(jié)果一致。提示針康法可以通過抑制AIFmRNA 的表達減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，發(fā)揮腦保護作用。另外，細(xì)胞凋亡不僅與AIF 有關(guān)，更與細(xì)胞表面的死亡受體Fas 有關(guān)。Fas 作為細(xì)胞表面具有轉(zhuǎn)膜作用的蛋白，屬于腫瘤壞死因子（Tumornecrosisfactor,TNF）受體家族。當(dāng)Fas 的胞外域與其結(jié)合配體FasL 結(jié)合時可引發(fā)細(xì)胞凋亡。Fas-FasL 結(jié)合可誘導(dǎo)Fas 的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使Fas 的細(xì)胞內(nèi)死亡域（FasDD）和Fas 相關(guān)死亡域（FADD）相互作用，最終激活細(xì)胞內(nèi)源性和外源性兩種凋亡途徑以實現(xiàn)細(xì)胞凋亡[15]。馬飛等[16]已證實，當(dāng)腦組織發(fā)生缺血損傷時可促進Fas 表達上調(diào)，而當(dāng)下調(diào)Fas 表達水平時可抑制腦缺血損傷后神經(jīng)元的凋亡。這說明腦缺氧缺血性損傷可誘導(dǎo)Fas 參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過程。此外，有關(guān)本實驗中FasmRNA 在24 h時達到表達高峰，后逐漸下降的這一表達趨勢與各時間點細(xì)胞凋亡趨勢一致的結(jié)果，與秦彥強等[17]研究針刺預(yù)處理對急性MACO 大鼠細(xì)胞凋亡影響的有關(guān)結(jié)果吻合。說明針康法可以通過調(diào)控FasmRNA 的表達來避免凋亡的發(fā)生，更好的保護腦組織。

細(xì)胞凋亡是一種高度調(diào)節(jié)和能量依賴的程序性細(xì)胞死亡（Programmedcelldeath,PCD），對早期胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)定至關(guān)重要[18-19]。細(xì)胞在受損后是否發(fā)生凋亡，是由促凋亡因子與抗凋亡因子二者誰能更好的發(fā)揮主導(dǎo)作用所決定的，在該過程中如果實施有效的干預(yù)抑制促凋亡因子，則可最大程度的保護腦組織，減少損傷[20-21]。本實驗結(jié)果顯示，各時間點針康組細(xì)胞凋亡數(shù)較模型組、針灸組及康復(fù)組顯著減少（P＜0.05），說明針康法可有效減少缺氧缺血性腦損傷新生大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)。

綜上所述，通過本實驗可進一步闡明針康法抑制缺氧缺血性腦損傷新生大鼠細(xì)胞凋亡的機制。針康法不僅能下調(diào)AIFmRNA 的表達水平，而且還能下調(diào)FasmRNA 的表達水平，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進受損神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)與再生。